王麗芳， 張 宇， 韓金鳴， 祝 捷， 馮加純， 鄧 暉

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是累及神經肌肉接頭突觸后膜、導致信息傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制主要是由乙酰膽堿受體(acetylcholinergic receptor,AChR)抗體介導、依賴于細胞免疫、同時有補體參與。已有研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病或免疫缺陷病的發(fā)生發(fā)展與輔助性T(T helper，Th)細胞免疫網絡平衡失調密切相關[1]。近年來，隨著研究的深入，越來越多的Th細胞亞型被發(fā)現(xiàn)，包括Th1、Th2、Th17、Th22以及最近報道的濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cells，Tfh)[2]。各種Th細胞之間相互協(xié)同制約，維持機體的免疫平衡。MG是神經系統(tǒng)典型的自身免疫性疾病，關于Tfh細胞及其細胞因子與MG發(fā)病之間的關系鮮有報道，本研究將對MG患者外周血中Tfh細胞及其細胞因子進行研究，并結合不同Th細胞分泌的細胞因子進行全面分析，進一步認識輔助性T細胞在MG的發(fā)病中的作用，為未來通過調節(jié)Tfh、Th1、Th2、Th17、Th22等Th細胞之間的平衡治療MG提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Fortessa流式細胞分析儀 (Becton,Dickinson and Company)，淋巴細胞分離液(GE公司)。BB515 Mouse Anti-Human CD4，Alexa Fluor647 Rat Anti-Human CXCR5，BV605 Mouse Anti-Human PD-1，PE Mouse Anti-Human ICOS，BV510 Mouse Anti-Human CD45RO，PerCp-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD45RA，Human IFN-γ (CBA) Flex Set，Human IL-4(CBA) Flex Set，Human IL-17A(CBA) Flex Set，Human IL-21(CBA) Flex Set(BD Biosciences)。Human IL-22 ELISA Kit (R&D systems)。

1.2 研究對象 重癥肌無力組：收集就診于吉林大學第一醫(yī)院神經內科確診為全身型MG的門診或住院患者33例。該研究經吉林大學第一醫(yī)院倫理學委員會批準，患者簽署知情同意書。MG患者入組標準：臨床診斷為全身型MG的患者，其診斷標準包括：波動性骨骼肌無力、疲勞試驗陽性、新斯的明試驗陽性、肌電圖低頻重復電刺激顯示低頻遞減、高頻無變化[3]；排除標準：(1)合并其他自身免疫性疾病；(2)已應用免疫調節(jié)劑(包括糖皮質激素)治療。健康對照組：選取年齡、性別與MG患者相匹配的本院醫(yī)務人員34名，納入對象均無自身免疫病史和近期感染史。

1.3 實驗方法 重癥肌無力患者定量評分及分組：根據2000年美國重癥肌無力協(xié)會(myasthenia gravis foundation of America,MGFA)提出的the quantitative myasthenia gravis score (QMGs)對納入研究的MG患者進行評分，QMGs反映了MG患者的病情嚴重程度。根據MG患者胸腺CT掃描或胸腺病理結果，將患者分為胸腺正常組、胸腺增生組和胸腺瘤組。MG組及健康對照組年齡、性別相匹配(見表1)。人外周血單個核細胞和血清的制備：患者就診/入院后第2日上午8：00-10：00用肝素鈉真空抗凝管收取外周血4 ml，應用淋巴細胞分離液制備外周血單個核細胞用于Tfh細胞的檢測，檢測需在取樣后8 h內完成；用分離膠促凝管取外周血2 ml，通過離心獲取血清，用于IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-21、IL-22的檢測。流式細胞術檢測外周血中的Tfh細胞,應用Flow Jo 7.6.1軟件對流式檢測結果進行分析。分別測定CXCR5+CD4+T、ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T、CD45RO+CXCR5+CD4+T、CD45RA+CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例。CBA技術檢測血清中的IL-17A、IFN-γ、IL-4、IL-21，ELISA技術檢測血清中的IL-22(依說明書操作)。

2 結 果

2.1 MG組與對照組Tfh細胞各亞群及Th相關細胞因子的比較 用Flow Jo 7.6.1軟件測定Tfh細胞各亞群占CD4+T細胞的百分率。其中CXCR5+CD4+T細胞表示總的Tfh細胞，CD45RO+CXCR5+CD4+T細胞為記憶Tfh細胞或成熟Tfh細胞，CD45RA+CXCR5+CD4+T細胞為幼稚Tfh細胞，ICOS+CXCR5+CD4+T細胞和PD-1+CXCR5+CD4+T細胞為循環(huán)Tfh細胞或功能Tfh細胞。(1)MG患者外周血中CXCR5+CD4+T細胞、CD45RO+CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例較對照組高，差異具有顯著性(P<0.05)(見圖1a、b)；CD45RA+CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例兩組之間無顯著性差異(見圖1c)。(2)MG患者外周血中ICOS+CXCR5+CD4+T細胞、PD-1+CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例較對照組高，差異具有顯著性(P<0.05)(見圖2a、b)。(3)MG組血清中IFN-γ、IL-17A、IL-21含量較對照組增多，且有統(tǒng)計學意義(見圖3a～c)。MG組血清中IL-4較對照組略有增多，IL-22較對照組含量略有降低，但均無統(tǒng)計學意義。

2.2 MG組Tfh細胞及Th細胞相關細胞因子與MG嚴重程度的相關性分析 (1)通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，ICOS+CXCR5+CD4+T細胞的數(shù)量與QMGs無相關性(見圖4a);PD-1+CXCR5+CD4+T細胞的數(shù)量與QMGs正相關(r=0.405,P=0.019)(見圖4b)。(2)MG組IL-4含量與QMGs呈負相關，差異具有顯著性(P<0.05)(見圖4c)；IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-22與QMGs無顯著相關性。(3)ICOS+CXCR5+CD4+T細胞、PD-1+CXCR5+CD4+T細胞的數(shù)量與CD45RO+CXCR5+CD4+T細胞的數(shù)量正相關(r=0.500,P=0.003；r=0.410,P=0.018)。

2.3 Tfh、IL-21、IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-22與胸腺的關系 根據MG患者胸腺CT掃描或胸腺病理結果，將MG患者分為胸腺正常組(8例)，胸腺增生組(10例)，胸腺瘤組(15例)。3組間Tfh細胞比例及IL-21、IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-22含量均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 實驗對象一般資料

圖1 兩組間CXCR5+CD4+T、CD45RO+CXCR5+CD4+T、CD45RA+CXCR5+CD4+T細胞的比較

圖2 兩組ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細胞的比較

圖3 MG組與對照組血清中IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-4、IL-22的比較

圖4 Tfh細胞及相關細胞因子與QMGs的相關性分析

3 討 論

2000年Schaerli等[2]初次在扁桃腺中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的CD4+T細胞，其定位在淋巴濾泡，具有輔助B細胞活化成熟的功能，其特異性表達趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5)，被命名為濾泡輔助性T (follicular helper T,Tfh)細胞。在趨化因子CXCL13(CXCR5配體)的誘導下，Tfh和B細胞能共同遷移至淋巴濾泡，形成GC。目前認為Tfh細胞是輔助B細胞活化成熟的主要Th亞群，而Th1和Th2細胞的效應因子IFN-γ、IL-4在B細胞活化和Ig類別轉換中只發(fā)揮調節(jié)的作用。Tfh細胞輔助B細胞發(fā)生免疫反應，主要依賴于其特異性趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5)、程序性死亡分子1 (programmed death 1,PD-1)、誘導性協(xié)同刺激因子(inducible co-stimulator,ICOS)、特異性轉錄因子bcl-6 (B cell lymphoma 6)以及其它分泌的特異性細胞因子IL-21來發(fā)揮作用。2010年，Simpson等[4]首次將CXCR5+CD4+T細胞中高表達ICOS和PD-1的Tfh細胞定義為循環(huán)的Tfh(circulating Tfh)細胞。ICOS和PD-1對GC的形成和抗體分泌細胞的產生都發(fā)揮著重要作用。ICOS缺陷時，外周血和GC中CXCR5+CD4+T細胞及記憶B細胞嚴重缺失[5]。PD-1為CD28家族成員，是一種重要的免疫抑制分子，Tfh細胞高表達PD-1，PD-1與其配體相互作用抑制Tfh細胞的分化。Good-Jacobson等[6]研究發(fā)現(xiàn)PD-1缺乏時，長壽命漿細胞(long-lived plasma cells)數(shù)量減少，其機制為雖然PD-1的缺乏導致Tfh細胞數(shù)量增多，但Tfh細胞分泌細胞因子IL-21的能力降低，進而導致B細胞分化成熟減少。本實驗結果顯示全身型MG患者外周血中ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例較健康對照組高，提示Tfh細胞參與了MG的發(fā)生發(fā)展，支持Luo等[7]的Tfh細胞參與了MG發(fā)病的研究結果。本研究結果還顯示PD-1+CXCR5+CD4+T細胞與QMGs正相關，進一步證明了PD-1在全身型MG發(fā)病中可能起到致病性作用。

CD45RO+T細胞為記憶T細胞，CD45RA+T細胞為幼稚T細胞[8]。本研究結果顯示MG組ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細胞比例與CD45RO+CXCR5+CD4+T細胞比例正相關，且PD-1+CXCR5+CD4+T細胞比例與QMGs正相關，說明全身型MG患者外周血中記憶Tfh細胞越多，功能性Tfh細胞越多，患者病情越重。IL-21是Tfh細胞分泌的主要細胞因子，其對GC以及抗體的生成都起著至關重要的作用[9]。Tfh細胞也主要是通過IL-21來促進抗體分泌細胞的形成[8]。本研究結果顯示全身型MG患者血清中IL-21含量增多，提示IL-21參與了全身型MG的發(fā)病，未來有望通過拮抗IL-21來減輕MG患者的癥狀。

IL-17主要由Th17細胞分泌，Th17在宿主防御感染及自身免疫組織炎癥中發(fā)揮重要作用。應用抗IL-17抗體或抑制Th17細胞的分化，可以明顯減輕疾病的癥狀。Th17及其細胞因子IL-17在橋本甲狀腺炎患者外周血中增多。另外，Th17在GBS、多發(fā)性硬化、乙型肝炎、風濕性心臟病、支氣管哮喘等疾病發(fā)病中都起到一定作用[10]。本研究結果顯示全身型MG患者外周血清中IL-17A水平較對照組增多，與王等[11]的Th17參與了MG發(fā)病的研究結果一致。由此可見IL-17在多種自身免疫性疾病中均可能起到促進發(fā)病的作用，為將來自身免疫疾病的治療提供了新的方向。

IFN-γ主要是由Th1細胞分泌，主要調節(jié)IgG2a的產生，介導細胞免疫；IL-4主要由Th2細胞分泌，主要調節(jié)IgG1的產生，介導體液免疫。Th1、Th2分別通過分泌IFN-γ、IL-4實現(xiàn)相互抑制、自我增強的作用[12]。Th1、Th2細胞的失衡將會導致自身免疫性疾病、免疫缺陷病等的發(fā)生[13]。在EAE小鼠中，Th1細胞增多，Th2細胞缺乏，誘導或活化Th2細胞會抑制EAE或其他Th1介導的自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。Wu等[15]研究表明干燥綜合征小鼠經白芍總苷治療后IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4下降，提示白芍總苷可能是通過調節(jié)Th1/Th2平衡來發(fā)揮治療作用。本研究結果顯示，MG患者外周血中IFN-γ的水平較正常組升高，有統(tǒng)計學意義，提示全身型MG患者Th1分泌IFN-γ的功能增強，可能起到促進MG發(fā)病的作用；IL-4的含量較對照組略有增高，雖無統(tǒng)計學意義，但IL-4的含量與QMGs負相關，由此我們推測IL-4在MG發(fā)病中可能發(fā)揮保護作用，減緩MG的進展，未來我們將加大樣本量，進一步研究IL-4與MG之間的關系。

IL-22主要由Th22細胞分泌， Zheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)MG患者外周血中IL-17含量升高，IL-22含量降低，且IL-22含量與AchR抗體滴度負相關，推測IL-22在MG中發(fā)揮保護作用。本研究結果顯示MG組IL-22的水平較對照組降低，但無統(tǒng)計學意義，且IL-22與QMGs無顯著相關性。關于Th22及其細胞因子IL-22在自身免疫性疾病中到底發(fā)揮保護作用還是致病作用有待進一步的研究。

胸腺是T細胞發(fā)育成熟的免疫器官，其內的生發(fā)中心是T細胞與B細胞相互作用的主要場所，其具備自身抗體形成的所有要素。為了探究MG患者免疫狀態(tài)與胸腺類型的關系，我們將MG患者分為胸腺正常組、胸腺瘤組、胸腺增生組，分析3組之間Tfh細胞及IL-21、IL-4、IL-17、IL-22、IFN-γ的差異，結果發(fā)現(xiàn)3組之間無顯著性差異，但因例數(shù)較小不足以說明問題，下一步我們將加大樣本量，進一步研究MG患者與胸腺類型的相關性。

總之，我們的研究表明全身型MG患者體內存在異常增高的Tfh細胞，并與疾病嚴重程度相關，提示其可能促進MG發(fā)病。MG患者體內還存在異常增多的IL-21、IL-17、IFN-γ，提示它們在MG的發(fā)病中也起著促進作用。IL-4的含量與QMGs負相關，由此我們推測IL-4在MG發(fā)病中可能發(fā)揮保護作用。將來我們將加大樣本量，并通過研究治療前后上述細胞及細胞因子的變化，進一步明確它們在MG發(fā)病中的作用。

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