徐瓏洋， 伍雪英， 林 旭， 何進(jìn)宇， 張 林， 王志敏， 王英明， 徐亞歐

癲癇又名羊癲瘋，是大腦神經(jīng)元異常放電、導(dǎo)致短暫大腦功能異常的一種慢性疾病，據(jù)估算全球65億人口中有癲癇患者5500萬(wàn)人，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，一般人群的年患病率為5‰～7‰[1]，而其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，且研究較少，目前臨床抗癲癇類藥物的治療效果也不佳[2]。從20世紀(jì)初期，人們就通過(guò)遺傳學(xué)研究觀察癲癇的家族性發(fā)病傾向，并發(fā)現(xiàn)某些特定基因?qū)Πd癇發(fā)病起作用。

目前，在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HTR受體一共發(fā)現(xiàn)了7種，14個(gè)亞型，通過(guò)不同的交互能力和G蛋白激活磷脂酶C和D信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而5-HTR2C是唯一由RNA修飾調(diào)節(jié)的G蛋白偶聯(lián)受體，調(diào)節(jié)血清素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的傳遞，具有降低細(xì)胞興奮的功能[3]。5-HTR2C定位于X染色體q24區(qū)，含3個(gè)內(nèi)含子，編碼458個(gè)氨基酸，主要作用于中樞系統(tǒng)，包括脈絡(luò)叢、嗅核、梨狀核、帶狀核、邊緣系統(tǒng)的伏隔核、海馬杏仁核和基底神經(jīng)節(jié)的尾狀核和黑質(zhì)及外周神經(jīng)[3]，目前5-HTR2C作為抗癲癇藥物新的靶點(diǎn)已進(jìn)入臨床前及臨床評(píng)價(jià)階段。本研究采用PCR-SSCP,結(jié)合測(cè)序方法檢測(cè)癲癇患者與正常人5-HTR2C基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其多態(tài)性與特發(fā)性癲癇的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本均來(lái)自成都三六三醫(yī)院癲癇專科就診并確診為特發(fā)性癲癇患者220例，癲癇診斷根據(jù)發(fā)作史，目擊者對(duì)發(fā)作過(guò)程提供可靠的詳細(xì)描述，輔以腦電圖癇性放電、腦血管造影、核素腦掃描、CT、MRI等檢查證據(jù)共同確診。其中男性107例，年齡2～78歲，占患者總?cè)藬?shù)48.63%；女性113例，年齡5～79歲，占患者總?cè)藬?shù)51.37%。對(duì)照組標(biāo)本血液均來(lái)自成都三六三醫(yī)院健康體檢部人群一共200例，其中對(duì)照組年齡、性別、所屬地區(qū)構(gòu)成均與實(shí)驗(yàn)組匹配。以上所有病例均征得患者及家屬同意后簽署家屬知情同意書，采取靜脈采血的方法提取血液。

1.2 方 法

1.2.1 血液總DNA提取 采取靜脈采血的方法提取研究對(duì)象血液，血液標(biāo)本采回后放入含抗凝劑的10 ml離心管，至于冰箱-20 ℃中保存。DNA提取按照天根生化科技(北京)公司的血液DNA提取試劑盒操作進(jìn)行，取400 μl血液提取得到160 μl溶液，至于-20 ℃保存，防止DNA降解。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)NCBI公布的5-HTR2C基因序列(Gene ID:3358)，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物并將其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Primer-BLAST進(jìn)行引物在線比對(duì)，設(shè)計(jì)引物送生工生物有限公司合成(純度為PAGE級(jí))。rs113961355位點(diǎn)：上游引物5’-GGATGATATGATGAACCTAGCC-3’，下游引物5’-TTACAGGAATGAATGCACCG-3’，115 bp；rs114141491位點(diǎn)：上游引物5’-ACCCTAACCAAGACCAGAACG-3’，下游引物5’-GGCACCACATGATCAGAAACA，141 bp；rs113817908位點(diǎn)：上游引物5’-CTTGTCTCCCCATCCTTTCCCT-3’，下游引物5’-ACCTCTTGCTGCCTTGACCTTG-3’，259 bp。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè) 按照Takara公司Long Taq PCR Master Mix混合酶使用說(shuō)明配25 μl的反應(yīng)體系： Long Taq PCR Master Mix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃(rs113961355)/58 ℃(rs114141491)/64 ℃(rs113817908)30 s，延伸72 ℃ 30 s，延長(zhǎng)72 ℃ 10 min，共35個(gè)循環(huán)。

獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)由1～2%瓊脂糖凝膠水平電泳檢測(cè)，根據(jù)克隆基因大小確定電泳條帶為目的條帶，且條帶清晰、單一無(wú)雜帶干擾。

1.2.4 SNP位點(diǎn)檢測(cè)及測(cè)序 PCR產(chǎn)物變性后(取1 μl PCR產(chǎn)物加入9 μl LIS-SSCP變性緩沖液，混勻， 98 ℃變性10 min，之后迅速拿出PCR管置于冰上急速冷卻5 min)加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠上，200 V電泳90 min。銀染后出現(xiàn)特異性條帶，根據(jù)條帶分析結(jié)果，挑取不同帶型產(chǎn)物送生工生物有限公司測(cè)序。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)及χ2檢驗(yàn)檢測(cè)原理對(duì)5-HTR2C受體基因rs113961355、rs114141491、rs113817908多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率與等位基因頻率在病例組及對(duì)照組中是否存在顯著性差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析 以5-HTR2C受體基因rs113961355位點(diǎn)、rs114141491位點(diǎn)、rs113817908位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)紫外光照射均可見(jiàn)一條明亮清晰的熒光條帶大小分別為約115 bp、141 bp、259 bp與預(yù)期結(jié)果相符。

分別對(duì)5-HTR2C受體基因三位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有rs113817908位點(diǎn)處出現(xiàn)3種條帶，而其余兩點(diǎn)位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)變異條帶。結(jié)合基因測(cè)序顯示rs113817908位點(diǎn)為A/C突變，與預(yù)期結(jié)果相符，分別定義為AA、AC、CC 3種類型(見(jiàn)圖1)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析 采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)對(duì)癲癇病例組與正常對(duì)照組rs113817908位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行適應(yīng)性檢驗(yàn)，χ2值分別為189.68、185.40，P值小于0.005，差異極顯著,說(shuō)明5-HTR2C受體基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率在病例組及正常對(duì)照組均不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(見(jiàn)表1)。該結(jié)果可能是由兩種純合子個(gè)體受某種因素影響，存在潛在作用的選擇現(xiàn)象，從而導(dǎo)致無(wú)論病例組還是正常對(duì)照組的基因及基因型頻率差異極顯著。

2.3 基因頻率及基因型頻率獨(dú)立性檢驗(yàn)分析 采用獨(dú)立性檢驗(yàn)，研究特發(fā)性癲癇與rs113817908位點(diǎn)突變的關(guān)聯(lián)性。在病例組和正常對(duì)照組中等位基因A出現(xiàn)的頻率分別為89.32%、84%；等位基因C出現(xiàn)的頻率分別為10.68%、16%，C等位基因頻率在正常組中明顯高于病例組。在病例組和正常對(duì)照組中AA型基因出現(xiàn)的頻率分別為88.6%、83.5%；在病例組和正常對(duì)照組中CC型基因出現(xiàn)的頻率分別為10%、15.5%；在病例組和正常對(duì)照組中AC型基因出現(xiàn)的頻率分別為1.4%、1%。利用獨(dú)立性檢驗(yàn)計(jì)算出χ2為5.16，P值小于0.025，說(shuō)明H3位點(diǎn)基因多態(tài)性在病例組和對(duì)照組間差異顯著，該位點(diǎn)堿基突變與特發(fā)性癲癇有機(jī)器顯著的相關(guān)性(見(jiàn)表2)。

2.4 半盒型基因型頻率分析 5-HTR2C受體基因定位于Xq24區(qū)，癲癇組及對(duì)照組基因型分布χ2檢驗(yàn)表明，癲癇組H3位點(diǎn)男性患者攜帶C半盒子與女性患者攜帶C+(CC與CA)基因型的比率顯著低于正常組(男性：χ2=11.5693703，P<0.05；女性χ2=4.109905348，P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表1 5-HTR2C受體基因rs113817908位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表2 5-HTR2C受體基因rs113817908位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率

P<0.05表示差異顯著

表3 5-HTR2C受體基因rs113817908位點(diǎn)半盒子基因型頻率比較

A～C分別為CC、AA、CA基因型

圖1 5-HTR2C受體基因rs113817908位點(diǎn)測(cè)序圖譜

3 討 論

遺傳學(xué)研究觀察癲癇的家族性發(fā)病傾向，多數(shù)人認(rèn)為癲癇病具有遺傳傾向，但具體遺傳模式及治病基因尚未明確。目前研究表明，癲癇的發(fā)病是由多基因、多位點(diǎn)共同作用的結(jié)果。大量研究表明，5-HT及其受體5-HTR1A、5-HTR2C、5-HTR 3、5-HTR7等對(duì)癲癇的發(fā)病都具有重要作用[4]，對(duì)其神經(jīng)興奮起了抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)， 5-HTR2C受體基因缺失的小鼠呈現(xiàn)出偶發(fā)性癲癇綜合征,有時(shí)甚至導(dǎo)致死亡[3]，相比于對(duì)照組野生型小鼠，缺失5-HTR2C受體的小鼠發(fā)作更為敏感[5]，5-HTR2C受體基因被破壞的小鼠也可表現(xiàn)出癲癇的癥狀，且較正常的小鼠有較低的癲癇域值[2]。對(duì)大鼠用M-CPP(5-HTR2C受體激動(dòng)劑)可以抑制肌陣攣?zhàn)饔眯?yīng)可持續(xù)1 h，并在時(shí)間和數(shù)量上出現(xiàn)顯著的劑量依賴性[6]。曾有研究表明，M-CPP可加重強(qiáng)迫癥的發(fā)病概率，對(duì)此我們可將癲癇與強(qiáng)迫癥的發(fā)病做相關(guān)性研究[7，8]。國(guó)內(nèi)外目前關(guān)于5-HTR2C受體抑制癇性發(fā)作的機(jī)制研究尚少,有人認(rèn)為5-HTR2C受體在杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程中起到了約束的作用，還有研究證明它能抑制細(xì)胞內(nèi)外核質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的點(diǎn)燃[9]。

本研究所設(shè)計(jì)的rs113817908位點(diǎn)分布于5-HTR2C受體基因5’側(cè)翼，與基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。所研究的5-HTR2C 基因H3位點(diǎn)出現(xiàn)3種條帶類型，基因測(cè)序結(jié)果顯示第89位堿基突變，其基因型分布為AA、AC、CC,說(shuō)明此位點(diǎn)位A/C突變。平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)論癲癇組還是正常組中，基因及基因型頻率差異極顯著(P<0.005)，說(shuō)明5-HTR2C基因rs113817908多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率在兩組中都不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。從基因型分布來(lái)看純合子占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，該結(jié)果說(shuō)明雜合子受某種因素影響，導(dǎo)致雜合子個(gè)體不利于其選擇，從而導(dǎo)致雜合子顯著低于兩種純合子。另一可能的原因是，本研究所抽取的樣本在其表型上與雜合基因型有某種關(guān)聯(lián)，從而導(dǎo)致所選樣本出現(xiàn)此種現(xiàn)象[10]，這有待于進(jìn)一步研究。也有可能是因?yàn)楸狙芯克槿〉臉颖径嗉杏谥袊?guó)西南地區(qū)，受地域、人種的遺傳背景等因素影響。雖然中國(guó)西南地區(qū)人群相對(duì)均一性較好，遺傳背景基本相同，但也應(yīng)在不同地域的人群中進(jìn)行類似研究，以消除地域偏倚，同時(shí)也應(yīng)在家族連鎖不平衡研究中尋找更多的證據(jù)[11]。

利用獨(dú)立性檢驗(yàn)得到的χ2值為5.16，P值<0.025，表明rs113817908位點(diǎn)在特發(fā)性癲癇病例組和正常對(duì)照組中差異顯著，男性患者攜帶C半合子與女性患者攜帶C+(CC與AC)基因型的比率及C等位基因的頻率均明顯高于對(duì)照組，亦驗(yàn)證了這一假說(shuō)。說(shuō)明此位點(diǎn)與特發(fā)性癲癇有相關(guān)性，其位點(diǎn)突變可能與基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

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