耿春陽，李馳宇，李雅楠，任海軍，翟曉峰，劉波

1.大連理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，遼寧 大連 116024；2.大連市友誼醫(yī)院 普外科，遼寧 大連 116024；3.銳意微流控醫(yī)療科技（常州）有限公司，江蘇 常州 213111

引言

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱粘膜上的惡性腫瘤，是我國泌尿外科臨床上最常見的腫瘤之一。膀胱癌患者可表現(xiàn)出多種癥狀，如血尿、尿急、尿頻、盆腔疼痛等，而90%以上的膀胱癌患者最初的臨床表現(xiàn)癥狀是血尿，然而出血量與血尿持續(xù)時間的長短，與腫瘤的惡性程度和大小沒有明顯關(guān)系，這是膀胱癌高致死率的重要原因[1]。如果早期發(fā)現(xiàn)，膀胱癌5年生存率大概為94%，可見膀胱腫瘤的早期診斷可以極大地降低膀胱癌的致死率[2]。目前臨床上對于有尿路癥狀患者的出診篩查和對膀胱癌術(shù)后患者的復(fù)查主要手段有尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查、膀胱鏡檢查、尿路造影術(shù)和熒光原位雜交（Fluorescent in Situhybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)。其中尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查屬于無創(chuàng)檢測，但是其敏感性較低[3]；膀胱鏡檢查屬于有創(chuàng)檢測[4]；尿路造影術(shù)不支持活檢[5]；FISH技術(shù)費用過高[6]。因此，亟需一種新的無創(chuàng)檢測方法，既擁有較高的敏感性和特異性，同時費用低廉，足以讓大部分患者可以承受。

應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞檢測的微流控芯片技術(shù)在近十年逐漸出現(xiàn)[7]。為了實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的檢測，首先必須完成在微流控芯片內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的高效抓捕。細(xì)胞捕獲的手段有很多，目前微流控芯片用到的細(xì)胞捕獲技術(shù)主要基于光學(xué)、電學(xué)、流體力學(xué)以及抗原抗體結(jié)合等原理，通過微流控芯片內(nèi)部的特殊結(jié)構(gòu)和其他的技術(shù)相結(jié)合也是常用的方法。高菊逸等[8]設(shè)計出一種簡易的用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）捕獲的一種玻璃—聚二甲硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）型芯片。首先，玻片表面經(jīng)過氧等離子、硅烷化處理，使玻片表面能夠固定特異性抗體；然后通過抗原抗體特異性結(jié)合捕獲靶細(xì)胞，捕獲率可高達(dá)92%。巧妙的結(jié)構(gòu)設(shè)計同樣可以用于細(xì)胞的捕獲。Stott等[9]在芯片中設(shè)計出了一種人字形結(jié)構(gòu)用于CTC的捕獲，這種結(jié)構(gòu)讓血液樣品在微流控芯片中充分混合以增加CTC的捕獲效率，最后成功地在患有前列腺癌患者的血液樣品中捕獲觀察到了CTC。但截止目前，尚未見通過尿液抓捕檢測膀胱癌細(xì)胞的相關(guān)報道。

本文基于微流控芯片技術(shù)，通過設(shè)計芯片內(nèi)部特殊的抓捕結(jié)構(gòu)，結(jié)合抗原抗體吸附反應(yīng)特異性，探究抗體固定在芯片內(nèi)表面的最佳條件，實現(xiàn)從尿液樣品中特異抓捕和鑒定膀胱癌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 芯片設(shè)計與制備

結(jié)合目前已經(jīng)成熟的捕獲腫瘤細(xì)胞的方法，設(shè)計中將抗原抗體免疫吸附反應(yīng)原理結(jié)合到微流控芯片上，使其能夠準(zhǔn)確檢測尿液樣品中可能出現(xiàn)的膀胱癌細(xì)胞，以此作為標(biāo)準(zhǔn)來判斷患者是否患有膀胱癌。芯片的流體通道結(jié)構(gòu)，見圖1。通道結(jié)構(gòu)主要由尿液樣本入口、尿液樣品檢測單元和尿液樣本出口組成。

圖1 微流控芯片流體通道結(jié)構(gòu)平面圖

在檢測單元中，設(shè)置有半徑為25 μm的圓柱體陣列。其中每一行相鄰圓柱之間圓心間隔100 μm；相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行；圓柱體陣列交錯分布，間隔100 μm。圓柱體陣列之間的間隔恰好足夠腫瘤細(xì)胞通過并且可以起到延長實驗時間、減緩流速以及增加膀胱癌細(xì)胞的捕獲效率等一系列的作用。

該微流控芯片是透明的玻璃—PDMS芯片，所有通道和腔室采用PDMS（沈陽力天利源商貿(mào)有限公司）作為材料，并與0.17 mm厚度的玻璃片鍵合密封，構(gòu)成玻璃—PDMS芯片。

1.2 抗體固定條件探究

本文采用基于抗原抗體免疫吸附反應(yīng)的方式抓捕并鑒定膀胱癌細(xì)胞，首先探究最適宜的抗體固定條件。采用氨丙基三乙氧基硅烷（Aminopropyltriethoxysilane，APTES）硅烷化修飾玻片表面，使其具有固定蛋白質(zhì)抗體的能力。為了探究最佳的修飾玻片條件，本文使用異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行實驗，在顯微鏡下觀察拍照后使用圖像處理軟件計算熒光強度，以熒光強度代表被固定在玻片表面的抗體量。將硅烷化玻片的時間分別設(shè)定為1、5和20 min，在其他實驗條件完全相同的狀況下進(jìn)行實驗，觀察熒光強度并分析。隨后在硅烷化時間相同的情況下，將抗體孵育的時間分別設(shè)定為1.5、2和2.5 h，再次觀察熒光強度并分析。

1.3 膀胱癌樣品鑒定

取膀胱癌患者18例的病理組織作切片（大連市友誼醫(yī)院）作為驗證，病理切片采用經(jīng)典的蘇木精—伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin Staining，HE）進(jìn)行染色，通過常規(guī)組織形態(tài)學(xué)判斷是否是膀胱癌組織。同時取50 mL膀胱癌患者的尿液樣品，置于臺式高速低溫離心機中以800 G離心力離心10 min，小心去除上清廢液。將離心后得到的細(xì)胞置于玻璃底培養(yǎng)皿中，采用免疫熒光進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞的鑒定。在玻璃底培養(yǎng)皿里加入膠原促使細(xì)胞粘附在玻璃底上，在顯微鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞的存在后向培養(yǎng)皿內(nèi)加入1:200 磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Solution，PBS）稀釋的膀胱癌細(xì)胞特異性抗體Rabbit Anti-CD15 antibody，將玻璃底培養(yǎng)皿置于濕盒中4℃過夜；隨后取出培養(yǎng)皿，使用PBS清洗3遍洗去多余的一抗，隨后向培養(yǎng)皿中加入1:100 PBS稀釋的FITC標(biāo)記的熒光二抗Anti-Rabbit IgG，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1～2 h之后置于熒光顯微鏡下觀察是否有帶熒光的細(xì)胞。

1.4 膀胱癌細(xì)胞的抓捕鑒定

將1:100 PBS稀釋的CD15抗體通入芯片里面孵育2 h，確保抗體固定在芯片的檢測單元區(qū)域。隨后將離心得到的膀胱癌細(xì)胞懸浮液通入到芯片里面并在37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。由于膀胱移行上皮癌在所有膀胱癌中的比例超過90%[10]，所以本研究中使用膀胱移行上皮癌對應(yīng)的特異性熒光一抗來鑒定膀胱癌細(xì)胞，即向芯片內(nèi)灌注1:100 PBS稀釋的膀胱移行上皮癌細(xì)胞特異性熒光一抗。在37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后用PBS洗去多余的熒光一抗，置于熒光顯微鏡下觀察是否有帶熒光的細(xì)胞。

1.5 圖像分析與數(shù)據(jù)處理

使用ImageJ軟件（National Institutes of Health）處理得到的熒光圖像，可以得到熒光強度的具體數(shù)值。首先將所得熒光圖片導(dǎo)入軟件，計算各點的熒光強度，排除熒光強度為0的點之后將所得熒光強度相加除以參與計算的熒光點的個數(shù)，得到該幅圖像的平均熒光強度；然后重復(fù)該步驟得到5幅圖像的平均熒光強度作為一組實驗數(shù)據(jù)與其他條件下的實驗數(shù)據(jù)相比較。所得數(shù)據(jù)采用Execl（Microsoft，USA）統(tǒng)計平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，組間數(shù)據(jù)通過t-Test進(jìn)行比較，P＜0.05視為存在差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 硅烷化時間與抗體孵育時間對抗體固定效果的影響

通過實驗對比發(fā)現(xiàn)在硅烷化時間過長的情況下，APTES容易發(fā)生氧化反應(yīng)而喪失結(jié)合蛋白的能力；而如果硅烷化時間過短，則硅烷化并不徹底，也并不利于抗體在玻片上的固定（圖2）。在進(jìn)行了多組數(shù)據(jù)對比后，發(fā)現(xiàn)硅烷化時間為5 min時，抗體的固定效率最高，與其余組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 硅烷化時間與熒光強度的關(guān)系

通過實驗對比發(fā)現(xiàn)如果孵育時間太短，抗體并不能完全與硅烷化后的玻片充分結(jié)合導(dǎo)致固定抗體的量不足；然而孵育時間太長，抗體在玻片上富集可能導(dǎo)致抗體結(jié)構(gòu)改變而造成其功能喪失（圖3）。在進(jìn)行了多組數(shù)據(jù)對比后，可以看出實驗結(jié)果與預(yù)期相符合，在孵育時間為2 h時，熒光強度最大，抗體的固定效率最高。與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計性意義（P＜0.05）。

圖3 熒光強度與抗體孵育時間的關(guān)系

2.2 膀胱癌樣品鑒定

不同放大倍率物鏡下的膀胱癌患者的病理切片典型形態(tài)，見圖4。癌細(xì)胞的細(xì)胞核顯著增大，進(jìn)而出現(xiàn)核胞質(zhì)失調(diào)的現(xiàn)象，同時其細(xì)胞核出現(xiàn)畸形。此外，由于癌細(xì)胞DNA大量增加，染色質(zhì)明顯增多，染色呈藍(lán)紫色似墨滴狀。證明所取樣本為典型的膀胱癌樣本。

圖4 膀胱癌患者病理切片

然后對離心后的18例尿液樣品進(jìn)行免疫熒光鑒定，由于尿液樣品中的腫瘤細(xì)胞形態(tài)并不標(biāo)準(zhǔn)，而且有些病理組織碎片也能非特異性地結(jié)合抗體并發(fā)出綠色熒光，因此需要對比其白光下的照片進(jìn)一步確認(rèn)其是否為膀胱癌細(xì)胞，并在不同倍數(shù)的顯微鏡下反復(fù)觀察確認(rèn)。結(jié)果顯示，18例樣品中，有11例檢出了帶有綠色熒光的細(xì)胞。離心后的樣本細(xì)胞，經(jīng)過免疫熒光鑒定后，在白光下的圖片和激發(fā)光下的圖片，見圖5。說明從醫(yī)院得到的尿液樣品中含有膀胱癌細(xì)胞，而且所選抗體可以特異性識別膀胱癌細(xì)胞，可用于后續(xù)的芯片內(nèi)鑒定實驗。

圖5 膀胱癌細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.3 膀胱癌細(xì)胞的抓捕鑒定

在芯片捕獲單元內(nèi)部進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞的特異性抓捕實驗，結(jié)果見圖6。在加入熒光抗體并置于熒光顯微鏡下觀察之后，11例帶有腫瘤細(xì)胞的病人樣品中，都有被捕獲的細(xì)胞、各種組織以及細(xì)胞碎片發(fā)出綠色熒光，說明固定于玻片上的抗體特異性地捕獲了腫瘤細(xì)胞以及與其相關(guān)的組織碎片等。

圖6 芯片內(nèi)膀胱癌細(xì)胞的抓捕鑒定

3 討論

近年來，微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為癌細(xì)胞檢測的研究提供了很多新的思路，但是現(xiàn)在主要的實驗研究仍然不能很好地還原癌細(xì)胞生存的復(fù)雜環(huán)境。很多實驗選用實驗室培養(yǎng)的癌細(xì)胞進(jìn)行芯片的抓捕鑒定實驗，其檢測特異性可以比臨床高出數(shù)倍[11-12]。但是癌細(xì)胞存在的真實環(huán)境往往比較復(fù)雜，比如本研究中膀胱癌患者的癥狀之一是血尿，大量的血細(xì)胞將大大增加癌細(xì)胞抓捕鑒定的難度，也在一定程度上降低了實驗的特異性。微流控芯片作為一個新型的無創(chuàng)檢測平臺，具有高度的可行性和可重復(fù)性，本研究設(shè)計的這種微流控芯片制作簡單、成本低廉、適用于一次性使用并且能夠有效提升臨床檢測的效率。

在利用微流控芯片實現(xiàn)對膀胱癌細(xì)胞抓捕鑒定的過程中，特異性抗體結(jié)合到特定的檢測單元區(qū)域是芯片功能實現(xiàn)的重要內(nèi)容?？贵w作為一種蛋白質(zhì)，并不能長時間保存，而且變性之后的抗體也不能再用于特異性抗原的鑒定[13]，因此需要探究出最適宜的抗體固定條件。由于微流控芯片需要和潔凈的0.17 mm厚的蓋玻片鍵合，流體通道的底部是玻璃而四周和頂部是PDMS，所以只需將抗體固定在玻璃片上，檢測單元便具備了特異性抓捕和鑒定特定腫瘤細(xì)胞的能力。常用的修飾玻片表面方法有多聚賴氨酸修飾[14]、納米修飾[15-16]、以及戊二醛修飾[17-18]等。其中APTES修飾效果比較明顯，且易于工藝化操作，所以采用APTES修飾玻片表面使其具有固定蛋白質(zhì)抗體的能力。

在使用微流控芯片對膀胱癌患者尿樣中的膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行抓捕鑒定之前，先在培養(yǎng)皿里利用傳統(tǒng)免疫熒光方法對膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行提取鑒定。該方法雖然也能夠無創(chuàng)檢測鑒定膀胱癌細(xì)胞，但本文采用的微流控芯片方法與這種傳統(tǒng)免疫熒光方法相比，具有以下優(yōu)勢：① 通過微流控芯片進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞抓捕與鑒定，消耗的試劑量僅需微升級別，成本低；② 在微流控通道中，熒光強度容易進(jìn)行定量檢測與計算，而在培養(yǎng)皿難以實現(xiàn)；③ 微流控芯片更易實現(xiàn)大規(guī)模批量生產(chǎn)和自動化檢測。

在實際的實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，由于微流控芯片內(nèi)部尺寸微小，通常芯片內(nèi)流通的樣本量只有幾十微升，而膀胱癌細(xì)胞在尿液樣品中的數(shù)量又較為稀少，在實際檢測中并不能實現(xiàn)每次實驗都能夠特異性地抓捕到膀胱癌細(xì)胞。經(jīng)過數(shù)十次反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，調(diào)整灌注的速度和灌注的時間可以使實驗結(jié)果得到明顯改善。灌注速度太快，會導(dǎo)致抗體與樣品中膀胱癌細(xì)胞接觸的時間不足從而難以抓捕到膀胱癌細(xì)胞；灌注時間太短會導(dǎo)致進(jìn)入芯片的樣品量太少，也就導(dǎo)致進(jìn)入芯片的膀胱癌細(xì)胞的數(shù)量十分稀少。在優(yōu)化了灌注速度與灌注時間之后，雖然不能確保樣品中的所有膀胱癌細(xì)胞都被特異性捕獲，但是每次實驗都能特異性地捕獲到樣品中膀胱癌細(xì)胞。另外，在實驗中也發(fā)現(xiàn)了一些其他的不足之處，例如有時用于攔截細(xì)胞的PDMS陣列偶爾會非特異性地吸附一些細(xì)胞或者組織碎片，導(dǎo)致芯片捕獲到的細(xì)胞并非全都是膀胱癌細(xì)胞，不過這種非特異性的干擾可以通過本文采用的抓捕和鑒定兩種不同特異抗體交叉重復(fù)來排除，即固定在芯片內(nèi)部表面的一種特異性抗體抓捕樣本中的膀胱癌細(xì)胞，而通過針對另一種標(biāo)志性蛋白的帶熒光的特異性抗體再與之結(jié)合。非特異吸附的細(xì)胞或者組織碎片不能與帶熒光的特異性抗體結(jié)合。因此通過對比熒光與白光照片，即可排除非特異性干擾，并不影響到芯片實際功能的實現(xiàn)。

本文設(shè)計制備的微流控芯片具備了高特異性、低成本、無創(chuàng)檢測和能夠顯微鏡下觀察等一系列優(yōu)點。整個微流控芯片制作的方法簡單、透光性良好、特異性抓捕效果良好。該微流控芯片的成功設(shè)計和制備，豐富了臨床上針對膀胱癌檢測和復(fù)查的手段，彌補了一些傳統(tǒng)方法的缺陷，為臨床診斷提供了現(xiàn)有的模型和更廣闊的思路。

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