賴滿香 馮 娟 陳 俠 徐 哲 許意平

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520

南藥巴戟天味甘、辛，性微溫；歸腎、肝經(jīng)；具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕之功效；可用于治療陽痿，不孕，月經(jīng)失調(diào)，少腹冷痛，風(fēng)濕痹痛，筋骨痿軟等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明巴戟天具有強(qiáng)壯骨骼、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種藥理作用[2-6]。有文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，巴戟天多糖（morindae officinalis polysaccharide，MOP）為巴戟天抗骨質(zhì)疏松的有效成分，其具有提高成骨細(xì)胞（osteoblasts，OB）的增殖和堿性磷酸酶活性?；贠B來源于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）， 我們考慮MOP對(duì) BMSCs分化成OB的某些階段可能會(huì)有影響。基于此假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)觀察MOP體外對(duì)SD大鼠BMSCs增殖及骨向分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3月齡 SD 雌性大鼠，SPF級(jí)，體重240g（由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；低糖DMEM培養(yǎng)基（佳研生物科技有限公司）；胎牛血清（奧地利PAA公司）；CCK-8（日本同仁）；ALP測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；巴戟天多糖（陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs 細(xì)胞的獲取 采用全骨髓貼壁法[10]，取3月齡 SD 雌性大鼠1只，脫臼處死，無菌條件下取出大鼠股骨，用PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集混合液，1500r/min，離心4min。在離心后的細(xì)胞中加入含有15%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液并反復(fù)吹打，然后以1×106個(gè)/mL的密度將細(xì)胞接種到25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底約80%即可傳代，同時(shí)觀察細(xì)胞的生長形態(tài)變化。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD29、CD44、CD45和CD34的表達(dá)，以鑒定是否為BMSCs。

1.2.2 MOP對(duì)BMSCs 增殖及成骨分化的影響 取生長良好的第三代BMSCs，以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后添加對(duì)照組（不加藥組）、MOP（高、中、低劑量）組培養(yǎng)液。用CCK-8法分別檢測各組干預(yù) 1、3、5、7、9、11d BMSCs的 OD值，用PNPP法檢測經(jīng)各組干預(yù)14d的 ALP 含量以確定MOP促BMSCs向OB分化的最佳劑量并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為MOP組，空白組（未加藥的細(xì)胞組)，成骨誘導(dǎo)組（添加成骨誘導(dǎo)液的細(xì)胞組），各組干預(yù)后第7、14、21天收集細(xì)胞上清液，按ALP檢測試劑盒說明書進(jìn)行ALP 含量的測定，第21天進(jìn)行茜素紅染色，以評(píng)價(jià) BMSCs 的礦化能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件STATA 12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

剛接種的細(xì)胞多呈圓形，大小不一，胞體透亮，見圖1。24h后，可見部分細(xì)胞貼壁生長，48h 后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，呈圓盤狀并向外伸出突起，部分伸出偽足并呈短棒狀，可延長軸呈現(xiàn)漩渦狀，見圖2。細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：CD44、CD29陽性細(xì)胞比率分別為98.25%和96.31%，CD45、CD34陽性細(xì)胞比率分別為0.69%和0.58%，說明成功獲取到BMSCs。

圖1 接種24h內(nèi)的BMSCs（40×10）

圖2 接種2d的BMSCs（40×10）

2.2 MOP對(duì) BMSCs 增殖的影響

各組細(xì)胞對(duì)BMSCs增殖均呈明顯的時(shí)效關(guān)系，從3 d起細(xì)胞增殖加速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，約7～9d達(dá)到高峰，隨后進(jìn)行平臺(tái)期。各組間兩兩比較，結(jié)果表明，第1天，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第3 ～ 11天，與對(duì)照組比較， MOP高、中濃度組OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而低濃度組OD值升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MOP高濃度組與MOP中、低濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 MOP對(duì)BMSCs 骨向分化的影響

MOP高濃度組與對(duì)照組比較，MOP高濃度組與MOP中、低濃度組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 各組對(duì)BMSCs ALP的影響

采用 PNPP 法對(duì)誘導(dǎo) 7、14、21d后 BMSCs向OB 分化過程中 ALP 進(jìn)行測定，見表2。第7天及第14天時(shí)，與空白組比較，MOP組和成骨誘導(dǎo)組的ALP活性均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但MOP組效果不及成骨誘導(dǎo)組；第21天時(shí)，MOP組和成骨誘導(dǎo)組ALP活性均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與成骨誘導(dǎo)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組BMSCs的OD值（ ± s，n=6）

表1 各組BMSCs的OD值（ ± s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與中濃度組比較，bP ＜0.05；與低濃度組比較，cP ＜0.05

組別時(shí)間（d）11對(duì)照組 0.112±0.003 0.379±0.022 1.230±0.023 1.896±0.081 1.920±0.010 1.512±0.031高濃度組 0.138±0.002 0.589±0.016abc 1.486±0.006abc 2.071±0.054abc 2.427±0.150abc 1. 910±0.025abc中濃度組 0.129±0.062 0.560±0.301ac 1.454±0.045ac 1.918±0.001ac 2.113±0.005ac 1.802±0.001ac低濃度組 0.109±0.015 0.495±0.004 1.331±0.021 1.906±0.023 1.965±0.008 1.610±0.051 F 282.104 324.154 256.142 185.243 215.381 190.235 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 1 3 5 7 9

圖3 MOP對(duì)BMSCs ALP 活性的影響

表2 各組ALP活性測定結(jié)果（ ± s，U/100mL）

表2 各組ALP活性測定結(jié)果（ ± s，U/100mL）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，與成骨誘導(dǎo)組比較，△P ＜0.05

組別 時(shí)間（d）7 14 21空白組 3.0316±0.032 5.2101±0.200 5.1211±0.053 MOP組 5.121±0.022*△ 7.250±0.040*△ 6.238±0.081*成骨誘導(dǎo)組 6.4450±0.002* 8.6541±0.054* 7.5011±0.312*F 74.643 108.432 86.257 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)（ ± s，n=6）

表3 各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)（ ± s，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.05，與成骨誘導(dǎo)組比較，△P＜0.05

組別 礦化結(jié)節(jié)數(shù)（個(gè)）對(duì)照組 4.1±0.5 MOP組 5.6±0.2*△成骨誘導(dǎo)組 6.1±1.2*F 15.314 P＜0.05

2.5 各組對(duì)BMSCs 礦化能力的影響

采用茜素紅染色法檢測各組干預(yù)BMSCs 21 d后的礦化結(jié)節(jié)，結(jié)果見表3。各組均可見礦化結(jié)節(jié)形成，與空白組比較， MOP組和成骨誘導(dǎo)組礦化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與成骨誘導(dǎo)組相比，MOP組礦化結(jié)節(jié)數(shù)不及成骨誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

BMSCs 是從骨髓中分離的一類成體干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新能力及多向分化的潛能[11]。在體外，BMSCs易于分離培養(yǎng)及擴(kuò)增，在特定誘導(dǎo)條件下有很強(qiáng)的成骨能力，是研究骨代謝疾病應(yīng)用最主要的種子細(xì)胞。體外獲取BMSCs的方法常有貼壁篩選法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面分子標(biāo)記法及免疫磁珠分選法，其中前兩種方法常用，后兩種方法雖可獲得較高純度細(xì)胞，但因細(xì)胞數(shù)量少、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長、費(fèi)用較高等原因受到限制[12]。密度梯度離心法是根據(jù)單核細(xì)胞密度不同進(jìn)行梯度離心分離純化，其很容易造成BMSCs的丟失，增加了污染的機(jī)會(huì)。全骨髓貼壁法通過定期換液除去不貼壁細(xì)胞，經(jīng)3～4次傳代后可獲得純度較高的BMSCs，是目前應(yīng)該分離BMSCs最常用的方法[13]，故本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離BMSCs。BMSCs 的鑒定目前主要借助其表面抗原性加以區(qū)分，BMSCs 在細(xì)胞貼壁附著后表達(dá)CD29[14]，CD44[15]等多種表面蛋白，但不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD54和CD34等[16]。本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，BMSCs 表面CD29、CD44 表達(dá)量分別為98.25%和96.31%， CD45、CD34陽性細(xì)胞比率分別為0.69%和0.58%，說明本方法得到的 BMSC 純度很高，且操作簡單、穩(wěn)定高效。

CCK-8法是目前檢測細(xì)胞增殖的常用方法[17]，其原理是水溶性四唑鹽-WST-8在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比[18]。在酶標(biāo)儀上測定其OD 值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。此法重復(fù)性好，對(duì)細(xì)胞毒性小，檢測快速，靈敏度高，誤差少，結(jié)果更加準(zhǔn)確[19]。本實(shí)驗(yàn)CCK-8結(jié)果提示，巴戟天多糖高、中濃度組從第3天開始BMSCs的增殖明顯，第9天增殖達(dá)高峰，其中高濃度組作用優(yōu)于中濃度組，而巴戟天多糖低濃度組的BMSCs增殖并不明顯。說明高、中濃度的巴戟天多糖具有促BMSCs增殖的作用。

ALP是BMSCs向成骨細(xì)胞分化早期合成并分泌的成骨特異性的物質(zhì)，其為水解磷酸酯沉積羥基磷灰石提供必要的磷酸，開啟礦化，促進(jìn)細(xì)胞成熟，是骨形成的必需酶[20]。在BMSCs成骨分化早期，ALP表達(dá)隨著BMSCs向OB分化程度而增加，鈣化時(shí)達(dá)高峰[21]。因此，ALP通過作為衡量BMSCs向成骨細(xì)胞分化程度的重要指標(biāo)，以判定骨向分化后細(xì)胞的功能狀態(tài)[22]。研究證實(shí)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的BMSCs，其最早出現(xiàn)ALP表達(dá)量的增加，且ALP的表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間成正比[23]。礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生由于BMSCs骨向分化晚期，分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中的各種骨性蛋白與鈣、磷等分子相結(jié)合，產(chǎn)生羥基磷灰石結(jié)晶，逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，它是評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化功能的有效指標(biāo)[24]，也是成骨細(xì)胞的另一重要特征。因此，本實(shí)驗(yàn)選用ALP和礦化結(jié)節(jié)作為巴戟天多糖促BMSCs骨向分化的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，結(jié)果顯示，巴戟天多糖能夠提高 ALP 活性，增加其礦化結(jié)節(jié)數(shù)目，說明巴戟天多糖在一定程度上具有促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞的能力。

綜上所述，巴戟天的有效成分巴戟天多糖在體外能夠促進(jìn)BMSCs的增殖，提高ALP 活性及礦化結(jié)節(jié)數(shù)，說明巴戟天多糖具有促進(jìn)BMSCs增殖及骨向分化的能力，但其具體可以通過何種信號(hào)途徑發(fā)揮促成骨作用，仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 雷載權(quán)．《中藥學(xué)》[M]．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001：287．

[2] 洪懿燚，陳健．巴戟天對(duì)成骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（11）：1613-1616．

[3] 王雪俠，張向前．巴戟天醇提物對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影響[J]．中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（4）：17-19．

[4] 李楠，王和鳴，郭素華，等．巴戟天多糖含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用觀察[J].中國骨傷，2008，21（1）：39-41．

[5] 龍碧波，徐海衡，張新定．巴戟天抗疲勞藥理活性的實(shí)驗(yàn)研究 [J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24（2）：298-300．

[6] 張學(xué)新，肖柳英，潘競鏘．巴戟天對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞增殖及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J]．中藥材，2011，34（4）：598-601．

[7] 李楠，王和鳴，郭素華，等．巴戟天多糖對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子 ɑ1m RNA 表達(dá)的影響[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（8）：517-519．

[8] 崔可賾，劉亦恒，張壽，等．巴戟天多糖含藥血清對(duì)體外成骨細(xì)胞 DKK-1 表達(dá)的影響[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，4（23）：871-872．

[9] Grove J E， Bruscia E，Krause D S， et al. Plasticity of bone marrow derived stem cells[J].Stem cells，2004，22（4）：487-500.

[10] 李蘭蘭，陳玲肖，馬炬明．大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，1（52）：7-10．

[11] Grove JE，Bruscia E，Krause DS，et al.Plasticity of bone marrow derived stem cells[J].Stem cells，2004，22（4）：487-500.

[12] 譚 琦，黃政德，王立鳳．大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法的研究[J]．湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（7）：74-76．

[13] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等．建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13 （6）：1064．

[14] Devine SM.Mesenchymal stem cells：will they have a role in the clinic[J].J Cell Biochem Suppl，2002，38：73-79.

[15] Colter DC，Sekiya I，Prockop DJ.Identification of a subpopulation of rapidly selfrenewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（14）：7841-7845.

[16] 王艷雙，曲曉波，李楓，等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs)細(xì)胞毒最佳實(shí)驗(yàn)條件的研究[J]。北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，15（5）：610-614.

[17] 陳沖，焦寧，靖景艷，等.臺(tái)盼藍(lán)拒染法、MTT法、CCK-8法在研究AS2O3細(xì)胞毒性作用中的意義[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（12）：24-26.

[18] 侯春梅， 李新穎， 葉偉亮， 等．MTT 法和 CCK8 法檢測懸浮細(xì)胞增殖的比較[J]．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2009，33：400-401．

[19] 徐鋼，裴啟洋，鞠成國，等．CCK-8法檢測狗脊不同炮制品對(duì)成骨細(xì)胞的影響[J]．中國中藥雜志，2013，38（24）：4319-4323．

[20] Siena RI，Specker BL，Jimenez F，et al. Biochemical bone markers，bone mineral content and bone mineral density in rats with experimental nephritic syndrome[J].Ren Fail，1997，19（3）：409.

[21] Sammons J，Ahmed N.The role of BMP-6，IL-6，and BMP-4，In mesenchymal stem cell-dependent bone development： effects on osteoblastic differentiation induced by parathyroid hormone and vita-min in D3[J].Stem Cell，2004，13（3）：273.

[22] 李銳冬，黃偉．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨過程的誘導(dǎo)因素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[J]．中國組織工程與臨床康復(fù)，2010，14（ 36）：6805- 6808．

[23] 孫宏，蔡國鋒，尚莉莉，等．葛根素對(duì) SD 大鼠 MSCs 增殖及骨向分化的影響 [J]．中醫(yī)藥信息，2016，33（4）：27-31．

[24] 傅淑平，張榮華．不同濃度梓醇對(duì) SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（10）：2398-2400．