尚冰清，周 丹，朱 宏，劉 昱，郭麗麗，湯仁仙，寇艷波

（徐州醫(yī)科大學，1.免疫與代謝重點實驗室；2.臨床醫(yī)學系院，江蘇 徐州 221006）

基因的過表達和沉默是研究基因功能的重要手段。但是由于某些基因的編碼產物在特定的細胞時期對細胞具有毒性或其減少嚴重影響細胞正常生長甚至導致細胞死亡，給這些基因生物學功能的闡明帶來的極大地困難。此外，隨著研究的深入，有報道表明某些基因表達水平的不同所引起的生物學表型也截然不同[1-2]。因此，可人工調控表達系統(tǒng)的建立對基因功能的研究將具有非常重要的意義。

近些年研究者們開發(fā)出了許多種類的可誘導表達系統(tǒng)，1995年由Gossen等[3]發(fā)現(xiàn)并改造的Tet-on系統(tǒng)尤為受關注。環(huán)境中沒有四環(huán)素（tetracycline，Tc）或其衍生物如強力霉素（doxycycline，DOX） 存在時下游基因處于表達抑制狀態(tài)，當Tc或DOX存在時下游基因啟動表達[4]。傳統(tǒng)的Tet-on系統(tǒng)具有可控性好、本底表達水平低、細胞毒性小等特點，但是它也存在一定的不足，如傳統(tǒng)的Tet-on系統(tǒng)為雙載體系統(tǒng)需要同時對TetR表達載體和目的基因表達載體同時進行遺傳操作，并且目的基因過表達無法統(tǒng)一檢測或實時監(jiān)測。

熱休克蛋白90（heat shock proteins 90，HSP 90）在細胞中含量豐富，約占細胞蛋白總量的1%-2%，其靶蛋白多在細胞生長調控及存活方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)HSP90α在腫瘤細胞中的表達量為正常細胞的2-10倍，例如：HBV相關性肝細胞癌，其含量的表達與腫瘤分級分期相聯(lián)系[5-6]，提示其與細胞的惡性轉化密切相關，并且HSP90α已作為腫瘤標記物應用于癌癥的早期篩查。不同表達水平的HSP90α對肝癌發(fā)生發(fā)展的作用研究將一定程度上加深人們對肝癌發(fā)生機制的認識。

該研究通過對傳統(tǒng)雙載體逆轉錄病毒Tet-on系統(tǒng)的改造建立了單載體Tet-on系統(tǒng)，并在啟動子下游引入增強綠色熒光蛋白（Enhancegreen Fluorescent Protein，EGFP）編碼基因使過表達的目的蛋白標記EGFP標簽，便于后續(xù)檢測和實時觀察。新的Tet-on-EGFP系統(tǒng)應用于肝癌細胞HepG2中HSP90α的過表達，通過使用不同濃度DOX的誘導不同水平Hsp90α過表達，為進一步機制研究提供了有力的遺傳操作工具。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

肝癌細胞HepG2（徐州醫(yī)科大學免疫與代謝重點實驗室）；pRetroX-Tet-on雙載體系統(tǒng) （中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所）；限制性內切酶及連接酶（Thermo Fisher Scientific）；質粒提取試劑盒，PCR產物純化試劑盒，凝膠回收試劑盒 （Omega）；PCR試劑盒 （Takara）； DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清 （Serana）；Lipofectamine 2000 （Invitrogen）；嘌呤霉素 （Sigma）；強力霉素 （生工生物）；逆轉錄試劑盒（Takara）；熒光定量PCR試劑盒（Takara）；EGFP、GAPDH蛋白抗體 （Abcam）；ECL發(fā)光劑（Bio-Rad）；CCK-8試劑盒（日本同仁）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 HepG2細胞培養(yǎng)

HepG2細胞于含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2，一般2-3天傳代一次。

1.3 單載體Tet-On-EGFP系統(tǒng)載體構建

1.3.1 目的基因hsp90αORF的擴增與純化 由NCBI基因庫中獲取hsp90α基因編碼序列。利用軟件Primer 5.0設計引物并分別在上游和下游引物5'端引入限制性內切酶NotI和MluI識別位點及對應的保護堿基，上游引物序列：5'AAGG AAAAAAGCGGCCGCATGCCCCCGTGTTCGGGCG 3'，下游引物序列：5' CGACGCGTTTAGACTACTTCTTCCATGC GTGATGTGTCG 3'。以肝癌細胞HepG2 cDNA為模板經PCR擴增獲得hsp90α全長基因片段（產物大小2579 bp）。利用純化試劑盒純化PCR產物，純化產物進行電泳分析。

1.3.2 表達質粒

pRetroX-Hsp90a-EGFP-Pur的構建 以質粒pcDNA3.1-EGFP為模板PCR擴增EGFP編碼基因，通過MluI和EcoRI雙酶切連接連入pRetroX-Tight-Pur，獲得質粒pRetroX-EGFPPur。將1.3.1中純化的PCR產物和pRetroX-EGFP-Pur用NotI和MluI雙酶切，連接獲得質粒pRetroX-Hsp90a-EGFP-Pur，測序無誤后用于后續(xù)實驗。

1.3.3 rtTA表達盒的擴增和單質粒Tet-on系統(tǒng)的構建

以pRetroX-Tet-On Advanced為模板PCR 擴增rtTA表達盒，并在其兩端引入限制性內切酶BglII識別位點。將rtTA表達盒和pRetroX-Hsp90a-EGFP-Pur經BglII酶切及去磷后連接獲得最終質粒pRetroX-Hsp90a-EGFP-Tet-On。

1.4 細胞轉染及篩選

HepG2生長至80%時利用Lipfectamine 2000進行轉染，轉染后5 h更換含有10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，并于48 h后胰酶消化重新接種于含有1 mg/ml 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中進行篩選，能夠正常生長的細胞即含有pRetroX-Hsp90a-EGFPTet-On質粒。

1.5 RT-PCR

收集不同濃度DOX誘導后的HepG2細胞，提取RNA，取總RNA 1 μg進行逆轉錄獲得總cDNA，以不同組的cDNA為模板利用Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測hsp90α轉錄情況，內參為β-actin，引物序列如下：5'GGCATCGTGATGGACTCCG 3'，5'GCTGGAAGGTGGACAGCGA 3' （β-actin）；5'T G C C T C T G G T G AT G A G AT G G T T 3' ，5'GGTGACTGACACTAAAGTCTTCCCC 3' （hsp90α）。

1.6 Western Blot

收集不同濃度DOX誘導后的HepG2細胞，RIPA裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣總蛋白15 mg進行SDS-PAGE，轉印至PVDF膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫孵育2 h洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后檢測EGFP和內參GAPDH強度。

1.7 細胞增殖實驗

HepG2細胞消化后血球板計數，調整細胞濃度至4×104個/ml，分為四組（分別加入DOX使終濃度為0，100，250，500 ng/mL）接種于96孔板中每孔100 μl，每組15孔（3個時間點，每個時間點5個平行），于0 h，24 h和48 h通過CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數據采用“±s”表示，多個樣本均數的比較用方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 單載體Tet-On-EGFP系統(tǒng)載體構建

分別通過PCR擴增EGFP編碼基因、HSP90α編碼基因、rtTA-Advanced表達盒，目的產物經凝膠回收后依次進行酶切、純化、連接得到目的基因表達載體pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP，如圖1所示，1、2、3泳道為PCR擴增結果，Hsp90α編碼基因2565 bp，EGFP編碼基因1607 bp，rtTAAdvanced表達盒長1525 bp。pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP通過ApaI限制性內切酶消化驗證，產生條帶分別為8247 bp和2666 bp和998 bp，載體測序無誤后用于后續(xù)實驗。

圖1 目的片段PCR產物及限制性內切酶酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳1、2、3泳道分別為Hsp90α編碼基因、EGFP編碼基因、rtTAAdvanced表達盒，4泳道為pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP經ApaI酶切結果，M泳道為Marker。

2.2 DOX誘導目的蛋白的表達

通過脂質體法將目的基因表達載體pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP轉染至HepG2細胞中，經G418（500 μg/ml）篩選后得到穩(wěn)定轉染細胞株，分別添加終濃度為0，100，500，2500 ng/ml的DOX誘導基因表達，24 h后通過熒光顯微鏡、熒光定量PCR以及Western blot檢測EGFP和目的蛋白的表達，并比較不同濃度DOX誘導能力的差異。如圖2A所示，轉染基因表達載體pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP的HepG2細胞添加DOX誘導24 h后能夠觀察到明顯的綠色熒光，而未添加DOX基本無熒光，同樣Western blot結果表明EGFP隨DOX濃度不同出現(xiàn)表達量的差異，DOX為500 ng/ml時EGFP表達量最高（圖2B）。與之相一致的是，熒光定量PCR結果表明隨著DOX存在時hsp90α存在明顯的誘導表達現(xiàn)象，且500 ng/mL誘導作用最強（圖2C）。

2.3 hsp90α表達水平影響HepG2增殖

為進一步檢測，不同濃度DOX誘導Hsp90α表達對HepG2增殖的影響，進行了CCK-8實驗。穩(wěn)定轉染pRetroXTet-On-Hsp90α-EGFP的HepG2細胞消化后調整細胞濃度，分為四組，接種于96孔板中分別用不同濃度DOX誘導，每隔24 h利用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況。由圖3可知，未經DOX誘導前，四組細胞數目基本一致，誘導48 h后添加500 ng/ml或2500 ng/ml DOX組增殖明顯高于對照，而100 ng/ml DOX組與對照組沒有統(tǒng)計學差異，說明Hsp90α促進HepG2增殖具有一定的劑量依賴性。

圖2 DOX誘導后目的蛋白表達檢測。

圖3 CCK-8檢測細胞增殖情況。

3 討 論

大量研究已證實：四環(huán)素調控系統(tǒng)能夠有效降低基因泄露[7-8]、時間空間特異性調控基因表達[9]，且相對于其他系統(tǒng)的誘導因子如熱休克、激素，Tc作為抗生素對細胞毒性小，誘導所需的劑量低，可應用于長期調控表達的細胞、動物模型。

四環(huán)素調控系統(tǒng)包括Tet-on與Tet-off系統(tǒng)。該實驗選擇Tet-on系統(tǒng)，在有DOX時，tetR可與tetO結合目的基因得到表達，撤去dox 轉錄即被抑制[10]。由于活體攝取要比清楚快得多，因此其在基因轉錄方面要快于Tet-off系統(tǒng)。

相比較于傳統(tǒng)的Tet-on系統(tǒng)，需要兩次篩選轉染，操作繁瑣，該實驗設計的Tet-on單質粒載體系統(tǒng)，經一次轉染即可用于實驗，操作相對簡單。在啟動子下游引入EGFP編碼序列使過表達的目的蛋白C端標記EGFP標簽，便于后續(xù)檢測和實時觀察。不同濃度DOX展現(xiàn)出不同水平的誘導能力，一定程度上可用于某些蛋白的定量表達，為這些蛋白生物學功能的揭示提供了更有力的工具。

臨床統(tǒng)計數據表明HSP90α與肝癌的發(fā)生具有明顯的相關性，其在腫瘤細胞的增殖和分化、生存和移動及血管形成中發(fā)揮重要作用[11]。有研究表明，腫瘤細胞內過表達的HSP90α通過外泌體分泌于細胞外，與底物蛋白結合，促進腫瘤細胞的侵襲遷移，在腫瘤轉移過程中發(fā)揮作用。其中，基質金屬蛋白酶2（MMP-2）是腫瘤細胞外HSP90α的底物之一，分泌于細胞外的 HSP90α可能通過激活其底物蛋白MMP-2增強肝癌細胞侵襲遷移能力。同時，HSP90α也可以與其他伴侶分子聯(lián)合作用，實驗結果顯示，HSP90α和HSP70可能通過結合形成復合體調控MMP-2的成熟和活化，參與肝癌轉移潛能的形成[12]。HSP90α也可以通過調節(jié)細胞周期促進細胞增殖。腫瘤細胞在低氧、營養(yǎng)缺乏微環(huán)境中生存尤其依賴HSP90α。Hsp90α參與低氧誘導因子的信號傳導通路。HSP90α可作為一種正向調節(jié)因子參與血管再生[13]。

繼2013年在世界上首次證明HSP90α是一個全新腫瘤標志物并可用作肺癌檢測后，清華大學生命科學學院羅永章團隊在世界上首次證明，HSP90α可用于肝癌患者的檢測，靈敏度比現(xiàn)行檢測方法甲胎蛋白（AFP）大幅提高。目前，這一發(fā)現(xiàn)已被國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準臨床使用[14]。除此之外，亦有實驗證實，HSP90α高表達與肝癌分化程度相關，而與患者性別、病理類型、病理分期無關。楊婧[15]等證明HSP90α單克隆抗體不僅能明顯抑制肝癌移植瘤生長，而且具有抑制肝癌干細胞侵襲、成球和耐藥的能力。說明HSP90α在腫瘤干細胞侵襲和存活過程中起重要作用，具有作為肝癌干細胞治療靶點的潛力。

臨床統(tǒng)計數據表明Hsp90α與肝癌的發(fā)生具有明顯的相關性，且Hsp90α已作為腫瘤標記物用于肝癌早期的篩查。雖然已有研究提示Hsp90α高表達能夠促進肝癌細胞侵襲和增殖[16]，但是并沒有進一步研究揭示Hsp90α表達量與肝癌細胞侵襲和增殖的具體關系。該研究結果顯示hsp90α轉錄上調可以促進肝癌細胞HepG2的增殖，且增殖能力與hsp90α表達量存在一定的正相關關系，具體的分子機制還有待于深入探討。

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