李曉理

利福平(rifampicin, RFP)是世界衛(wèi)生組織推薦的一線抗結(jié)核藥物之一。利福平單獨或者與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用時，都可引起不同程度的肝損傷，但具體的發(fā)病機制仍未明確。高遷移率族蛋白BI (high mobility group box-1, HMGB1) 是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種強大的致炎細胞因子，可能與異煙肼、利福平合用所致的大鼠肝損傷有關(guān)[1]。丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)作為一種有效的HMGB1釋放抑制劑，可降低膿毒癥、蛛網(wǎng)膜下腔出血、肝癌等動物模型的死亡率[2-4]。目前，尚未見EP防治利福平致肝損傷的作用及其機制的報道。因此，本實驗通過復制利福平致肝損傷小鼠模型，探討EP對利福平致肝損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量18～20 g，由南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院提供[許可證號：SCXK(蘇)2015-0001]。

1.1.2 藥品及試劑 利福平，5 g/瓶，批號R3501，美國Sigma公司生產(chǎn)；丙酮酸乙酯，25 g/瓶，批號E47808，美國Sigma公司生產(chǎn)；HMGB1多克隆抗體，1 mg/mL，批號A515，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；小鼠血清生化檢測試劑，購自瑞士Roche公司；小鼠蛋白測定試劑盒、總膽汁酸(total bile acids, TBA)測定試劑盒、乙酰化高遷移率族蛋白B1(acetylated-high mobility group box-1, AC-HMGB1)測定試劑盒均由上海聯(lián)碩生物科技有限公司生產(chǎn)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 全自動生化分析儀，瑞士Roche Modular DPP產(chǎn)品；紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；光學顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；成像系統(tǒng)，美國阿爾法公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組、模型建立及給藥

1.2.1 藥物配備 RFP灌胃液配制：將RFP溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中配置成濃度為10 g/L的混懸液；EP液配制：將EP溶解到格林液中，配置成3.26 g/L的溶液，消毒，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模型建立和動物分組 參考文獻[5-6]。將小鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組、模型組和EP組，每組8只。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食進水，室溫22～25℃，相對濕度(50±5)%，明暗各12 h。正常對照組、模型組和EP組分別給予等量溶劑(0.5%羧甲基纖維素鈉)、利福平200 mg·kg-1·d-1、利福平200 mg·kg-1·d-1，每天1次定時空腹灌胃。EP組給予腹腔注射丙酮酸乙酯40 mg·kg-1·d-1，其余兩組每天1次腹腔注射等量溶劑(格林液)。連續(xù)給藥7 d后，處死全部小鼠。

1.2.3 標本采集 小鼠處死前，隔夜禁食、禁水12 h。處死前稱量小鼠體質(zhì)量，腹腔注射10%的水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉后摘除眼球取血、摘取小鼠肝臟。留取血清標本，-80℃凍存待測；稱肝臟濕重，計算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝濕重/小鼠體質(zhì)量×100%)；各組切取相同部位肝組織，10%福爾馬林緩沖液固定，用于觀察肝臟病理變化；余組織保存于液氮罐中，待測。

1.3 觀察指標及測定方法

1.3.1 一般情況觀察 每3天稱小鼠體質(zhì)量1次，觀察并記錄其體質(zhì)量變化、飲食情況、毛色、皮膚黏膜顏色、大小便、精神狀態(tài)及對外界刺激的反應情況等。

1.3.2 血清生化指標測定 用生化分析儀測定各組小鼠血清總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的水平。

1.3.3 肝組織病理學檢查 常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。在光學顯微鏡下，觀察肝組織的病理形態(tài)學變化[2]。

1.3.4 免疫組化法檢測肝組織中HMGB1蛋白的表達 免疫組化染色法采用PV二步法，參考試劑盒說明書操作。HMGB1多克隆抗體工作濃度1∶50。染色完成后，鏡下攝片。每張切片在高倍顯微鏡下(400倍)隨機選取5個不連續(xù)視野，用Image-Pro Plus 6.0測定平均光密度值(OD)。

1.3.5 肝組織勻漿 取肝組織100 mg，勻漿取上清液；采用考馬斯亮藍法測定肝組織蛋白濃度，ELISA法測肝組織TBA、AC-HMGB1的含量，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，羥胺法測定SOD活性，按照試劑盒說明書步驟進行操作。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對照組小鼠精神狀態(tài)、食欲較好，毛色光澤尚可，無黃染，對外界刺激反應較靈敏。模型組小鼠精神狀態(tài)差，腳掌可見輕度橘黃染，大小便呈橘紅色，進食和活動情況較前減退，體質(zhì)量較前輕度下降，對外界刺激反應遲鈍。EP組小鼠精神狀態(tài)稍差，腳掌皮膚黃染程度、大小便顏色較模型組均減輕，體質(zhì)量較前稍增長，對外界刺激反應尚可。造模后第7天模型組小鼠肝濕重及肝指數(shù)較正常對照組升高(P<0.05)，EP組小鼠肝濕重及肝指數(shù)較模型組降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 造模后第7天3組小鼠體質(zhì)量、肝濕重、肝指數(shù)比較

2.2 血清肝生化指標變化 與正常對照組比較，模型組的血清TBIL、DBIL、ALP、ALT升高(P<0.05)；與模型組相比，EP組的TBIL、DBIL、ALP、ALT降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠血清生化指標變化

2.3 肝臟大體形態(tài)及組織病理學變化 正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，被膜光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟，鏡下肝小葉清晰可見，肝細胞排列整齊，肝細胞未見異常。模型組小鼠肝臟部分偏黃，邊緣稍鈍，質(zhì)地基本柔軟，鏡下可見肝細胞排列紊亂，中央靜脈周圍的肝細胞可見明顯的空泡變性、脂肪變性，部分肝細胞可見嗜酸性變、核溶解或固縮。EP組小鼠肝臟外觀基本正常，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細胞空泡變性、脂肪變性較模型組明顯減輕。詳見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理學改變(HE×400)

2.4 肝組織HMGB1的表達情況 光鏡下可見，正常對照組小鼠肝細胞HMGB1微量表達，胞漿內(nèi)和細胞核均可見淡黃、棕黃色著色(見圖2)，其中陽性表達多位于肝細胞核中，OD值為 (0.18±0.027)。模型組小鼠肝細胞HMGB1的表達增強，胞漿內(nèi)和細胞核中著色增強，且胞漿中陽性表達增強 (見圖2)，OD值為(0.30±0.039)，高于正常對照組(P<0.001)。EP組小鼠肝細胞HMGB1表達較模型組減少，陽性表達多位于肝細胞核中(見圖2)，OD值為(0.24±0.016)，低于模型組(P<0.001)。 三組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=56.37，P<0.001)。

圖2 各組小鼠肝HMGB1的表達(IHC×400)

2.5 肝組織中AC-HMGB1、TBA、SOD、MDA的水平 與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中AC-HMGB1、TBA、MDA升高(P<0.05)，SOD下降(P<0.05)；與模型組比較，EP組小鼠肝組織中的AC-HMGB1、TBA、MDA降低(P<0.05)，SOD升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠肝組織中AC-HMGB1、TBA、MDA、SOD水平變化

3 討論

利福平廣泛用于抗結(jié)核治療，單獨或者與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用時均可引起不同程度的肝損傷，是抗結(jié)核藥物最常見的毒副作用之一，也是結(jié)核患者停止治療的最常見的原因之一。因此，研究利福平致肝損傷的發(fā)病機制及其防治手段具有重要的臨床意義。

本實驗結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠給予利福平灌胃7 d后肝細胞出現(xiàn)明顯的空泡變性、脂肪變性，部分肝細胞有嗜酸性變，核溶解或固縮，同時伴有血清TBIL、DBIL、ALP、ALT及肝組織TBA水平明顯升高。表明已成功復制出利福平致肝損傷小鼠模型，但脂肪變性及炎癥反應不及文獻[5]報道明顯，考慮可能與小鼠品系不同有關(guān)。

HMGB1是一類廣泛存在于真核細胞內(nèi)的非組蛋白，對維持核小體穩(wěn)定、DNA 重組、復制、修復及轉(zhuǎn)錄有重要作用[7]。當外界有適當?shù)男盘柎碳ぜ毎麜r，HMGB1賴氨酸殘基被乙酰化，然后釋放到細胞外，參與炎癥反應[8]。AC-HMGB1參與了梗阻性膽汁淤積性肝損傷的發(fā)病及發(fā)展過程[9]，降低HMGB1的乙?；娇梢悦黠@改善膿毒癥相關(guān)性腦病的認知功能障礙、減輕肝組織缺血再灌注損傷的程度[10-11]等。AC-HMGB1可作為藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)的免疫損傷指標，對判斷DILI的嚴重程度及預后有重要價值[12]。前期實驗[2]表明，HMGB1表達增加與分布異常與異煙肼聯(lián)用利福平致大鼠肝損傷的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。本實驗研究顯示，正常對照組肝細胞HMGB1微量表達，且陽性表達多位于細胞核中，與文獻[2]報道有差異，可能與不同實驗中所用鼠的種屬不同有關(guān)，但不能排除不同實驗中所用不同溶劑的影響，可能需進一步驗證。模型組肝細胞HMGB1的表達增多，胞漿明顯，且AC-HMGB1的表達明顯增多，同時HMGB1的表達強度和分布與肝臟的病理嚴重程度相一致，提示HMGB1表達增加和分布異常、AC-HMGB增加與利福平致肝損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

MDA、SOD分別是反應機體內(nèi)氧化、抗氧化程度的重要指標。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，利福平可以導致小鼠肝組織中MDA水平升高，SOD活性降低，與文獻[13]報道相符；予以EP干預后，MDA水平下降，SOD活性升高。提示EP可以通過抗氧化作用減輕利福平致小鼠肝損傷。

EP作為一種有效的HMGB1釋放抑制劑，不僅可以抑制HMGB1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，而且可以降低HMGB1的乙酰化程度，減少HMGB1釋放到細胞外，減輕促炎細胞因子反應網(wǎng)絡的級聯(lián)反應，達到對臟器的保護作用[14]。本研究結(jié)果顯示，EP可顯著減輕小鼠肝組織的病理損傷，同時降低肝組織HMGB1和AC-HMGB1的表達。說明EP可以通過降低小鼠肝組織中HMGB1及AC-HMGB1的水平來減輕利福平致小鼠肝損傷的程度。

HMGB1是損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)中的一員，由215個氨基酸組成，其23、45、106位點上的半胱氨酸殘基使HMGB1成為一種氧化還原敏感分子；它的易位、釋放和活動均受到氧化還原反應的嚴格控制[15]。隨著活性氧自由基的積累，巨噬細胞等炎癥細胞可產(chǎn)生大量的HMGB1并促使其乙?；尫诺郊毎?，同時HMGB1又可以通過釋放炎癥因子來促進機體的氧化應激。丙酮酸乙酯是一種有效的抗氧化劑，其抗氧化機制可能與其a-酮羧基及親脂特性有關(guān)，a-酮基可直接與過氧化物產(chǎn)生還原反應，清除過氧化物及其氧自由基等有害物質(zhì)[16]。嚴重燙傷內(nèi)毒素血癥大鼠TNF-a和HMGB1水平與丙二醛水平呈正相關(guān)，與SOD活性呈負相關(guān)，予以丙酮酸乙酯抗氧化應激后，可以減輕炎癥反應[17]。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸乙酯降低HMGB1及其乙?；?、減輕利福平致小鼠肝損傷的程度的作用，可能與其抗氧化作用有關(guān)，但具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，HMGB1表達、分布異常及AC-HMGB1與利福平致小鼠肝損傷的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)；丙酮酸乙酯可通過抗氧化，降低HMGB1及其乙酰化水平、調(diào)節(jié)HMGB1分布來減輕利福平致藥物性肝損傷。HMGB1有望成為防治利福平致肝損傷的一個關(guān)鍵靶點。

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