關瑞攀，白智偉，王 倩，唐筆鋒，崔秀明，劉迪秋

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南省三七資源可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500)

在生長發(fā)育過程中植物會受到多種生物和非生物脅迫，其中真菌病害是一類非常嚴重的生物脅迫。病原真菌在侵染植物的過程中會釋放包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases，PG)在內(nèi)的果膠降解酶和半纖維素降解酶來水解細胞壁，降低宿主細胞的抗性[1]。相應地，植物形成了特殊的防御機制來抑制真菌的侵染，如生成多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP)結合并抑制真菌分泌的PG活性[2]。PGIP蛋白屬于富含亮氨酸重復(Leucine-rich repeats ，LRRs)蛋白超家族，包含了一個由10個不完整的LRR組成的功能性結構域，每個LRR由24個保守的氨基酸殘基(xxLxLxx.NxLx..GxIPxxLxxL.xxL)組成，該序列是PGIP蛋白家族的共有序列，介導蛋白之間的相互作用[3]。

PGIP響應逆境脅迫，作為重要的植物防御蛋白在植物的防衛(wèi)反應過程中起重要作用。殼聚糖(Chitosan)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)處理草莓(Fragariachiloensis)能減少其被灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染引起的灰霉病，在此過程中，F(xiàn)cPGIP1和FcPGIP2表達上調(diào)[4]。棉花(Gossypiumhirsutum)GhPGIP1的轉(zhuǎn)錄水平受MeJA、水楊酸(Salicylic acid ，SA)、過氧化氫(H2O2)、傷害處理以及黃萎病菌(Verticilliumdahlia)、枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.vasinfectum)侵染的誘導[5]。煙草(Nicotianatabacum)NtPGIP響應低溫(4 ℃)、SA、脫落酸(Abscisic acid，ABA)、鹽(NaCl)處理以及疫霉菌(Phytophthoranicotianae)侵染[6]。將菜豆(Phaseolusvulgaris)PvPGIP2轉(zhuǎn)化入小麥(Triticumaestivum)過量表達，在轉(zhuǎn)基因小麥一葉期葉片接種根腐病菌(Bipolarissorokiniana)的孢子懸液，接種后72 h轉(zhuǎn)基因小麥與非轉(zhuǎn)基因小麥相比，病斑數(shù)少且病斑面積也小，表明PvPGIP2在小麥中的過量表達增強了小麥對根腐病菌的抗性，并且轉(zhuǎn)基因小麥J82-23aT株系還提高了對禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的抗性[7-8]。在水稻(Oryzasativa)中過表達OsPGIP1增強了轉(zhuǎn)基因水稻對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的抗性[9]。大豆(Glycinemax)GmPGIP3在小麥中的表達提高了敏感型小麥對根腐病菌的抗性[10]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen)為五加科人參屬多年生植物，主要產(chǎn)自云南省文山州，具有“生打熟補”的功效，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥。三七中主要的活性成分是三七總皂苷，研究表明，三七皂苷有改善記憶損傷模型動物的學習記憶功能、抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇及提高機體免疫力等多種生物活性，是預防心腦血管疾病的重要藥物[11-14]。三七生長周期長，性喜溫暖陰濕，對光敏感，需要在遮陽網(wǎng)下栽培，其獨特的生長環(huán)境易誘發(fā)病蟲害的發(fā)生，尤其是根腐病等真菌病害。在前期研究中，筆者從三七中克隆得到一個PGIP基因PnPGIP，表達分析結果表明，PnPGIP響應MeJA、乙烯(Ethylene，ETH)、H2O2和SA的處理，MeJA預處理三七接種茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)后，PnPGIP的表達量呈現(xiàn)出先逐漸降低后緩慢升高又急速下降的趨勢[15]。

為了研究PnPGIP的功能，本研究構建了PnPGIP的原核表達載體以獲得PnPGIP的原核表達蛋白，并分析在體外的抑菌活性，進一步構建了PnPGIP的植物表達載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草并分析了轉(zhuǎn)基因煙草對茄腐鐮刀菌的抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型(Wild type，WT)煙草種子經(jīng)表面消毒后播種在1/2 MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)的無菌幼苗培養(yǎng)5周后用于轉(zhuǎn)化遺傳試驗。試驗中用到的病原真菌膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、茄腐鐮刀菌和輪枝狀鐮刀菌(F.verticillioides)均保存于-4 ℃，使用前從斜面取出少量菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上活化。

1.2 試驗方法

1.2.1PnPGIP原核表達載體構建及His-PnPGIP重組蛋白的誘導表達和純化 本試驗采用pET-32(a)為原核表達載體。在擴增PnPGIPORF的1對特異引物的5′端分別添加限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ的識別位點，合成特異性引物5′-GAATTCATGTTGTTAC

TCCTCTTCTTGATCT-3′和5′-GTCGACTCAAAATTTCC

AAGGATCAAGTG-3′用于擴增PnPGIP的ORF。擴增產(chǎn)物先連接至克隆載體pMD-18T(TaKaRa，Japan)，然后提取pMD-18T-PnPGIP質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ消化后獲得PnPGIP的ORF，pET-32(a)空載體經(jīng)過同樣的限制性內(nèi)切酶消化后與PnPGIP的ORF連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，提取pET-32(a)-PnPGIP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過PCR篩選陽性菌株。

吸取1 mL BL21陽性單克隆菌液轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μL/mL 氨芐Ampicillin，Amp)中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8。后將菌液冰上靜置30 min左右，加入IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)至終濃度為1 mmol/L，之后分別在30，37 ℃誘導外源蛋白表達，7 h后取樣。取未添加IPTG的菌液和加入相同濃度IPTG的空載體菌株為陰性對照進行SDS-PAGE以分析重組蛋白的最適誘導溫度。最后加大培養(yǎng)量，在最適條件下誘導重組蛋白表達，取500 mL菌液收集菌體，加入結合Buffer和溶菌酶后超聲30 min以破碎菌體，然后低溫離心40 min，收集上清。重組蛋白的分離和純化參考Chen等[16]的方法進行。

1.2.2 重組蛋白的體外抑菌試驗 將4種供試真菌活化后接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。在菌落邊緣均勻擺放無菌濾紙片(直徑6 mm)，依次將純化的重組蛋白液點在放好的濾紙片上，點樣量依次為10，25，50，100 μg，使用無菌水和溶解蛋白的Buffer為陰性對照。將真菌置于28 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄重組蛋白對幾種病原真菌菌絲生長的影響。

1.2.3PnPGIP植物過表達載體的構建 在擴增PnPGIPORF的1對特異引物的5′端分別添加限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的識別位點，上下游引物的序列分別為5′-GGAAGACCAATGTTGTTACTCCTCT-3′和5′-TCCATTGAGTACTAGGGAAACCATG-3′。擴增產(chǎn)物首先連接到pGEM-T載體上用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化pGEM-T-PnPGIP質(zhì)粒獲得PnPGIP的ORF，然后與雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA2300S連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，通過PCR挑選陽性單克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒，采用凍融法將pCAMBIA2300S-PnPGIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌株中，篩選獲得陽性克隆。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導的煙草遺傳轉(zhuǎn)化 活化攜帶pCAMBIA2300S-PnPGIP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株，在無菌條件下侵染W(wǎng)T煙草無菌苗的葉盤，侵染結束吸干葉盤上的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d，之后葉盤轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)(25 ℃，光照16 h/d)。將葉盤分化再生出的幼苗移至含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L頭孢霉素的生根培養(yǎng)基中誘導幼苗生根。用CTAB法提轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的DNA，以轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，用擴增PnPGIP的特異性引物進行PCR，篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。隨機挑選10個T0轉(zhuǎn)基因單株通過套袋自交結合PCR分析獲得T2轉(zhuǎn)基因株系。

1.2.5 熒光定量PCR(Quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR) 用總RNA試劑盒(Gene Star，康潤)提取T2轉(zhuǎn)基因煙草葉片的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。后取0.2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PnPGIP特異性引物(5′-CATACCTCAAGAGACTTCGGCTTC-3′和5′-AGGGAGAGTGGAATTGAGCCAT-3′)進行Real-time PCR，以分析PnPGIP在T2轉(zhuǎn)基因煙草中的表達水平。反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，之后進行熔解曲線分析，qRT-PCR中每個反應均設置3次重復，以煙草NtACT基因(GenBank登錄號AB158612.1)作為內(nèi)參基因。將Ct值最大的轉(zhuǎn)基因株系中PnPGIP的表達值設置為1，采用2-ΔΔCT法計算得出其他株系中PnPGIP的相對表達水平。采用SPSS軟件中Duncan′s multiple range test分析轉(zhuǎn)基因株系與WT之間的差異顯著性。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草抗病性分析 選擇表達水平較高的4個T2轉(zhuǎn)基因煙草株系進行抗病性分析。取大小均一且完全伸展的轉(zhuǎn)基因煙草和WT煙草葉片，分別用滅菌的槍頭造成傷口并在傷口處接種200 μL的茄腐鐮刀菌孢子懸液。將接種好的葉片放置在濕潤的濾紙上，用保鮮膜包裹后置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，光照16 h/d)中。接種7 d后收集葉片，觀察葉片的發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 PnPGIP原核表達蛋白的SDS-PAGE分析及純化

在前期研究中，從三七中克隆得到1個多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因PnPGIP，表達特性分析表明，PnPGIP受三七根腐病菌茄腐鐮刀菌侵染的誘導，還響應茉莉酸甲酯、水楊酸等脅迫相關信號分子的處理。為了分析PnPGIP蛋白的活性，本研究構建了PnPGIP的原核表達載體pET-32(a)-PnPGIP，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中表達。添加1 mmol/L IPTG條件下分別在30，37 ℃誘導PnPGIP蛋白的表達，SDS-PAGE檢測結果如圖1所示，重組蛋白分子量約為46 ku，30 ℃，1 mmol/L IPTG、200 r/min的誘導條件下重組蛋白有較高的表達量。根據(jù)這個條件大量誘導表達重組蛋白后純化蛋白，SDS-PAGE分析結果表明，純化的蛋白液中重組蛋白的濃度和純度都很高。

M.蛋白Marker；1，2. 1 mmol/L IPTG、200 r/min條件下，分別在37，30 ℃誘導重組蛋白表達；3.未添加IPTG的蛋白表達條帶；4.添加1 mmol/L IPTG誘導空載體轉(zhuǎn)化菌體蛋白表達條帶；5.鎳柱純化后的重組蛋白。

M.Protein Marker；1，2.The expression of recombinant protein induced at 37，30 ℃，1 mmol/L IPTG and 200 r/min，respectively；3.Band of the expression of recombinant protein without IPTG；4.Band of cell protein expression of cells with no-load body added 1 mmol/L IPTG；5.Band of recombinant protein purified from nickel column.

圖1PnPGIP原核表達重組蛋白的誘導和純化
Fig.1InductionandpurificationofprokaryoticexpressionrecombinantproteinofPnPGIP

2.2 PnPGIP重組蛋白明顯抑制4種病原真菌菌絲的生長

分別將10，25，50，100 μg PnPGIP重組蛋白依次點在濾紙片上，培養(yǎng)2 d后觀察，發(fā)現(xiàn)滴有ddH2O的濾紙片對膠孢炭疽菌、核盤菌、茄腐鐮刀菌和輪枝鐮刀菌菌絲生長幾乎沒有任何抑制作用，而滴有磷酸緩沖液的濾紙片表現(xiàn)出極輕微的抑制效果(圖2)。相對于這2個陰性對照，PnPGIP重組蛋白對4種供試真菌的生長均具有很明顯的抑制作用，并且隨著蛋白量的增加，抑制活性也逐漸增強(圖2)，尤其是100 μg PnPGIP蛋白液對膠孢炭疽菌和茄腐鐮刀菌菌絲的生長具有很強的抑制作用。

ddH2O.無菌雙蒸水；Buffer.磷酸緩沖液；A.膠孢炭疽菌；B.核盤菌；C.茄腐鐮刀菌；D.輪枝鐮刀菌。ddH2O.Double distilled water；Buffer.Phosphate Buffer；A. C. gloeosporioides；B.S. sclerotiorum；C.F. solani；D. F. verticillioides.

2.3 PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草的產(chǎn)生和篩選

為了深入研究PnPGIP的生物學功能，本試驗構建了植物過表達載體pCAMBIA2300S-PnPGIP，采用根癌農(nóng)桿菌介導分4批侵染了100多個煙草葉盤。再生的煙草幼苗首先經(jīng)過卡那霉素篩選，再挑選生長正常的植株提取基因組DNA。使用擴增PnPGIP的特異引物以轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板進行PCR，篩選出56棵陽性轉(zhuǎn)基因植株，其中部分煙草PCR篩選結果如圖3所示。將煙草種在溫室中，PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在生長過程中沒有可見的形態(tài)差異。隨機挑選10個生長正常的T0轉(zhuǎn)基因單株通過套袋自交結合PCR分析獲得T2轉(zhuǎn)基因株系。

2.4 PnPGIP在T2轉(zhuǎn)基因煙草中大量表達

為了確保PnPGIP在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定遺傳并表達，本研究利用qRT-PCR分析T2轉(zhuǎn)基因植株中PnPGIP的表達量。結果表明，在這10個T2轉(zhuǎn)基因株系中均檢測到PnPGIP轉(zhuǎn)錄物的積累，而在WT煙草中沒有發(fā)現(xiàn)PnPGIP的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(圖4)。在P9株系中，PnPGIP的表達量較其他轉(zhuǎn)基因株系高，是P23的30多倍。P1、P6和P17中的外源基因表達量也很高，在P23株系中，PnPGIP的表達量最低。由此可見，過表達載體上的CaMV 35S啟動子正常指導PnPGIP在轉(zhuǎn)基因植株中的表達，且表達穩(wěn)定。挑選表達量較高的4個轉(zhuǎn)基因株系進行下一步試驗。

P.陽性對照pCAMBIA2300S-PnPGIP質(zhì)粒；WT.野生型煙草；M.DL2000 Marker。P.Positive control pCAMBIA2300S-PnPGIP plasmid；WT.Wild type tobacco；M.DL2000 Marker.

WT.野生型煙草；P1、P6、P9、P14、P17、P20、P23、P28、P31、P35.PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草株系；圖中不同小寫字母表示差異有顯著性(P<0.05)。

WT.Wild type tobacco；P1，P6，P9，P14，P17，P20，P23，P28，P31，and P35. Lines ofPnPGIPtransgenic tobacco；The letters a，b，c，d，e，f，g，h，i，j and k，showed the significant difference (P<0.05).

圖4T2PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草的表達水平分析
Fig.4ExpressionlevelanalysisofPnPGIPT2transgenictobaccolines

2.5 PnPGIP超表達顯著增強了轉(zhuǎn)基因煙草對茄腐鐮刀菌的抗性

為了評價PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草的抗性水平，株系P1、P6、P9、P17以及WT煙草的幼嫩葉片受傷處理后接種茄腐鐮刀菌的孢子懸液，接種7 d后葉片的發(fā)病情況如圖5所示，WT葉片在接種7 d后出現(xiàn)了嚴重的黃化、腐爛現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因株系的葉片只在接種的傷口附近出現(xiàn)了輕微腐爛以及葉片局部的黃化。顯然，PnPGIP在煙草中的超表達大大增強了轉(zhuǎn)基因煙草對茄腐鐮刀菌的抗性，表明PnPGIP是三七中參與抵抗根腐病菌侵染的一個重要防衛(wèi)基因。

WT.野生型煙草葉片；P1、P6、P9、P17.PnPGIP轉(zhuǎn)基因煙草。WT. Leaves of wild type tobacco；P1，P6，P9，P17.Leaves of PnPGIP transgenic tobaccos.

3 討論

因其化學成分具有多種多樣的生物活性，三七已經(jīng)成為中草藥基礎和應用研究的焦點之一。然而，三七的生長周期長、病害多發(fā)，農(nóng)藥的大量使用對三七藥材安全性的影響引起了廣泛的關注。而三七抗病遺傳育種方面的探索研究鮮見報道，遺傳育種研究的滯后已成為三七產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的限制因素。云南省三七資源可持續(xù)利用重點實驗室發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯能顯著誘導三七對根腐病菌的抗性，進而通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得了大量響應茉莉酸甲酯的抗病相關基因，并對PnPGIP、PnNAC1等基因進行了克隆和表達特性分析[15，17]。為了深入認識三七的抗病機制并挖掘抗病功能基因，本研究采用反向遺傳學方法驗證了PnPGIP的功能。

PGIP是一類富含亮氨酸重復序列蛋白，屬于植物胞外的富含亮氨酸重復序列蛋白超家族，是植物防御系統(tǒng)的一部分[18]。病原真菌侵染植物的過程中釋放PG水解植物細胞壁及胞間層的果膠物質(zhì)，在此過程中PGIP通過與PG結合形成寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonides，OGs)，從而抑制PG活性，且OGs能激發(fā)植物體內(nèi)的防御反應從而增強植物的抗性[19-21]。將煙草基因NtPGIP轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達，得到的重組蛋白明顯抑制辣椒(Capsicumannuum)疫霉(P.capsici)的PG活性[6]。辣椒CaPGIP1、CaPGIP2和CaPGIP3的重組蛋白對煙草鏈格孢菌(Alternariaalternata)和煙草炭疽病菌(C.nicotianae)的PG活性有明顯的抑制作用[22]。然而，PGIP蛋白的直接抑菌活性卻鮮有報道。將深綠木霉(Trichodermaatroviride)帶有幾丁質(zhì)結合域的chit42和菜豆基因PG1P2轉(zhuǎn)入油菜(Brassicanapus)中共表達，從陽性轉(zhuǎn)基因油菜葉片中提取的粗蛋白具有很高的幾丁質(zhì)酶活性和PGIP活性，平板抑菌實驗表明，粗蛋白還抑制核盤菌菌絲的生長，抑制率約為44%[23]。將火把梨(Pyruspyrifolia)PpPGIP基因轉(zhuǎn)入煙草中過量表達，轉(zhuǎn)基因煙草粗蛋白對莖點霉菌擬莖點霉(Phomopsissp.)、鏈格孢菌(Alternariasp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)和黑曲霉(Aspergillusniger)菌絲的生長有不同程度的抑制作用[24]。本研究構建了三七PnPGIP的原核表達載體，誘導表達PnPGIP重組蛋白，用純化的重組蛋白進行平板抑菌實驗，結果發(fā)現(xiàn)，PnPGIP重組蛋白對膠孢炭疽菌、核盤菌、茄腐鐮刀菌和輪枝鐮刀菌的菌絲體生長均有非常明顯的抑制作用，體外的抑菌活性表明，PnPGIP蛋白可能作為一種抑菌蛋白直接參與三七抵抗病原真菌侵染的防御過程。

反向遺傳學研究提供了PGIPs是抗病功能基因的更多證據(jù)。與非轉(zhuǎn)基因小麥相比，PvPGIP2轉(zhuǎn)基因小麥的花穗在受禾谷鐮刀菌侵染后的赤霉病癥狀較WT減少25%以上，可見，PvPGIP2的表達增強了小麥對禾谷鐮刀菌的抗性[25]。Atpgip1或者Atpgip2在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過量表達顯著減輕了由灰葡萄孢引起的病害癥狀，用禾谷鐮刀菌接種Atpgip1或Atpgip2轉(zhuǎn)基因擬南芥花序，死花序百分比分別較WT降低了30%和50%[8，26]，而利用反義基因沉默AtPGIP1基因的表達，增加了擬南芥對灰葡萄孢的敏感性[27]。葡萄(Vitisvinifera)VvPGIP1轉(zhuǎn)入煙草中表達，陽性轉(zhuǎn)基因株系葉片接種灰葡萄孢菌孢子懸液后的感病率較WT降低了47%～69%[28]。辣椒CaPGIP1的表達使轉(zhuǎn)基因煙草受鏈格孢菌侵染引起的癥狀降低54.4%～62.7%，并且轉(zhuǎn)基因煙草的炭疽病感病率降低了54.6%～57.7%[22]。除此之外，CaPGIP1轉(zhuǎn)基因煙草的病斑數(shù)量和平均病斑面積較WT也顯著減少，而CaPGIP1基因沉默的辣椒接種疫霉菌后產(chǎn)生的病斑是WT和轉(zhuǎn)空載體辣椒的3倍。本研究中，三七PnPGIP的過量表達增強了轉(zhuǎn)基因煙草對茄腐鐮刀菌的抗性，表明PnPGIP在三七受茄腐鐮刀菌的侵染過程中起重要作用。

綜上所述，三七PnPGIP的原核表達蛋白對多種植物病原菌具有很強的體外抑菌活性，在模式植物煙草中的過量表達大大提高了轉(zhuǎn)基因煙草對茄腐鐮刀菌的抗性，PnPGIP無疑是三七中參與根腐病菌防衛(wèi)反應的重要抗病基因。隨著基因工程技術的廣泛應用，來源于名貴中藥材三七中的重要抗病功能基因PnPGIP將成為植物抗病基因工程中新的候選基因。

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