陳 吉， 田 燕， 楊 磊

1.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010； 2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院消化內(nèi)科； 3.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院病理科

反流性食管炎(reflux esophagitis, RE)是常見的消化道動(dòng)力障礙性疾病，屬胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)的一種，是由于胃或十二指腸內(nèi)容物長期、反復(fù)反流至食管所致的食管黏膜慢性炎癥，其主要臨床表現(xiàn)為消化道癥狀，部分患者表現(xiàn)為食管外癥狀[1]。RE在西方國家的發(fā)病率為10%～20%[2]。標(biāo)準(zhǔn)劑量的質(zhì)子泵抑制劑(PPI)可使RE的癥狀緩解率和治愈率達(dá)到85%[3]，但是仍有10%～40%的患者對(duì)PPI治療無效或癥狀不能徹底緩解。

Barrett’s食管(Barrett’s esophagus, BE)是指食管末端柱狀上皮取代鱗狀上皮，可增加食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EA)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。BE胃鏡檢出率6.8%，引起越來越多的關(guān)注[4]。EA患病率逐年增長，且預(yù)后差。因此，對(duì)BE及EA的早期診療非常重要。人們普遍認(rèn)同，EA要經(jīng)歷RE-BE-異型增生-EA這一演化過程，RE作為起始病變，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，普遍認(rèn)為RE是由于抗反流屏障、酸清除機(jī)制及黏膜屏障等防御機(jī)制與來自胃及十二指腸的侵襲因素之間的不平衡所致[5-6]，但具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。

血管緊張素Ⅱ受體1亞型(Ang Ⅱ type 1 receptor, AT1)、Mas受體(Mas receptor)分別是血管緊張素Ang Ⅱ、Ang-(1-7)的特異性受體，均為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的重要成分。RAS分布廣泛，存在于大多數(shù)器官包括胃腸道[7]。Ang Ⅱ是RAS中主要的生物活性肽。Ang Ⅱ的病理生理學(xué)效應(yīng)絕大多數(shù)是通過其作用于AT1來實(shí)現(xiàn)的。Ang-(1-7)可通過Mas發(fā)揮擴(kuò)張血管、降低血壓、抑制平滑肌細(xì)胞増殖、利尿、利鈉及抑制血管新生內(nèi)膜增生等多種生物學(xué)功能，是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的主要催化產(chǎn)物，同時(shí)也被認(rèn)為是Ang Ⅱ的內(nèi)源性拮抗因子。AT1、Mas表達(dá)量的多少在一定程度上決定了Ang Ⅱ、 Ang-(1-7)的生物學(xué)效應(yīng)。

RAS激素調(diào)節(jié)機(jī)制在宏觀控制消化道功能和消化道微循環(huán)中發(fā)揮重要作用[8]，本研究主要以AT1、Mas在RE、BE中的表達(dá)作為切入點(diǎn)，討論RE的發(fā)生、發(fā)展是否與食管黏膜局部RAS異常表達(dá)有相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年12月至2016年9月就診于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院)消化內(nèi)科符合入選標(biāo)準(zhǔn)且臨床資料完整的患者。正常食管黏膜30例，男22例，女8例，年齡(54.89±11.58)歲(24～78歲)，均以腹脹、中上腹不適為主要癥狀就診，行胃鏡檢查未見異常；RE 45例，男24例，女21例，年齡(58.69±14.13)歲(25～80歲)，聯(lián)合胃鏡及病理結(jié)果證實(shí)的RE組織標(biāo)本；BE 30例，男16例，女14例，年齡(57.30±11.81)歲(35～80歲)，聯(lián)合胃鏡及病理結(jié)果證實(shí)的BE組織標(biāo)本。組織標(biāo)本還應(yīng)排除合并下列情況者：食管其他器質(zhì)性疾病、胃十二指腸疾病及消化道手術(shù)史；惡性腫瘤患者；患有內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病或合并其他系統(tǒng)慢性器官功能衰竭；入組前3周內(nèi)服用非甾體抗炎藥(NSAIDs)、PPI、血管緊張素受體阻斷劑(ARB)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACEI)等藥物及飲酒史。 各組患者年齡組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SP免疫組化：將30例正常食管黏膜、45例RE、30例BE組織均經(jīng)質(zhì)量濃度為100 g/L的中性甲醛固定48 h以上， 經(jīng)脫水、浸蠟、包埋處理，分別連續(xù)切片3張，每張切片的厚度約5 μm，其中1張作HE 染色確定組織類型，另2張分別作以兔抗人AT1多克隆抗體、兔抗人Mas單克隆抗體作為一抗進(jìn)行SP免疫組織化學(xué)染色法。 具體步驟如下：60 ℃烤片40 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，100%、95%、85%、75%梯度酒精浸泡脫蠟；自來水充分沖洗后置于蒸餾水中；高壓鍋900 ℃抗原修復(fù)2 min，PBS沖洗5 min×3次；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；非免疫兔血清室溫孵育20 min；一抗(AT1/Mas)4 ℃過夜，PBS沖洗10 min×3次；生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔室溫孵育10 min，PBS沖洗10 min×3次；鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫孵育10 min，甩去試劑D，PBS沖洗5 min×3次；滴加DAB顯色3～6 min，自來水充分沖洗； 蘇木素復(fù)染7～15 s；乙醇脫水、二甲苯透明；中性樹膠封片、鏡檢。

1.2.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[9-10]：AT1、Mas陽性染色呈黃色或棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞的胞漿內(nèi)，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用半定量積分法判定結(jié)果，各切片均隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，然后觀察并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；根據(jù)免疫細(xì)胞染色結(jié)果評(píng)分，未著色計(jì)為0分，淺黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。綜合評(píng)分由兩類評(píng)分的乘積計(jì)算，0～1分計(jì)為陰性(-)，2～4分計(jì)為弱陽性(+)，5～8分計(jì)為陽性(++)，9～12分計(jì)為強(qiáng)陽性(+++)。將+、++、+++歸為陽性組計(jì)算陽性率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Krusral-wallisH非參數(shù)檢驗(yàn);對(duì)正常對(duì)照組、RE組、BE組用bonferroni法進(jìn)行多重比較(組間采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn));采用Kendall’s taur-b等級(jí)相關(guān)分析法分析AT1與Mas表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1食管不同黏膜組織的HE染色RE組織可見基底層厚超過15%，固有膜乳頭伸入上皮超過65%，且上皮內(nèi)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。BE組織可見柱狀上皮成片被覆于食管下段或呈島嶼狀散分布于鱗狀上皮黏膜組織內(nèi)(見圖1)。

2.2AT1在食管不同黏膜組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果如圖2所示，AT1表達(dá)于正常食管黏膜、RE、BE組織上皮細(xì)胞的胞漿中，其免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色，采用Krusral-wallisH方法檢驗(yàn)AT1在正常食管黏膜、RE、BE組織中的表達(dá)，秩均值分別為38.70、55.46、63.62，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.262,P<0.01)，表達(dá)呈逐漸升高趨勢。組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，正常對(duì)照組與RE組AT1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=463，P<0.05)；BE顯著高于正常對(duì)照組(U=243，P<0.01)；BE組高于RE組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=563.5，P>0.05)。

圖1 食管不同黏膜組織HE染色(HE 400×) A：正常組；B：RE組；C：BE組

圖2 AT1在食管不同黏膜組織中的表達(dá)(HE 400×) A：正常組；B：RE組；C：BE組

2.3Mas在食管不同黏膜組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果如圖3所示，Mas表達(dá)于正常食管黏膜、RE、BE組織的上皮細(xì)胞細(xì)胞漿中，其免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色，采用Krusral-wallisH法檢驗(yàn)Mas在正常食管黏膜、RE、BE組織中的表達(dá)，秩均值分別為68.47、52.43、38.38，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.985,P<0.01)，表達(dá)呈逐漸下降趨勢。組間采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，正常對(duì)照組與RE組Mas表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=461，P<0.05)；正常對(duì)照組與BE組的Mas表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=200，P<0.05)；RE組與BE組Mas表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=486.5，P<0.05)。

圖3 Mas在食管不同黏膜組織中的表達(dá)(HE 400×) A：正常組；B：RE組；C：BE組

2.4在食管不同黏膜組織中AT1與Mas表達(dá)的相關(guān)性采用Kendall’s taur-b等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)RE組、BE組中Mas與AT1之間的相關(guān)性。在RE組中，Mas與AT1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.303，P<0.05)(見表1)；在BE組中，Mas與AT1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.342，P<0.05)(見表2)。

3 討論

RE是在全球范圍發(fā)病率呈快速增長的消化道常見疾病，因此，本研究通過AT1及Mas蛋白的表達(dá)，探討RE的分子生物學(xué)機(jī)制，以期對(duì)提高人群生活質(zhì)量、RE的早期診治及降低BE和EA發(fā)生率有一定意義。

AT1受體為跨膜G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，是由359個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì)多肽鏈，分子量約為41 kD，為AngⅡ的特異性受體，主要分布于心、腦、肺、肝、胃腸道。AngⅡ作為RAS中主要的生物活性肽，具有收縮血管、調(diào)節(jié)機(jī)體電解質(zhì)平衡的作用。在局部組織中，AngⅡ通過與受體AT1、AT2結(jié)合發(fā)揮作用，其中主要是AT1受體。AT1與AngⅡ結(jié)合可發(fā)揮氧化應(yīng)激、血管收縮、交感神經(jīng)激活、血管加壓素的釋放和促進(jìn)細(xì)胞增生等作用。當(dāng)AT1表達(dá)升高時(shí)，AngⅡ所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)，可引起黏膜血管收縮，血供減少，局部黏膜缺血會(huì)增加胃腸和食管黏膜的脆弱性，進(jìn)而出現(xiàn)黏膜炎癥、糜爛、潰瘍及并發(fā)癥。食管黏膜微循環(huán)對(duì)食管黏膜的完整性發(fā)揮著重要作用，黏膜血流量可為細(xì)胞間隙提供更多碳酸氫鹽，并去除氫離子、二氧化碳和其他代謝物，以維持正常的黏膜酸堿平衡[11]，從而保障黏膜的防御作用。一旦AT1表達(dá)升高，可使食管黏膜屏障功能受損，水、電解質(zhì)及小分子物質(zhì)在食管黏膜的通透性就會(huì)增加，細(xì)胞間隙增寬，酸和蛋白酶反流至食管并作用于食管黏膜的神經(jīng)末梢，引起反酸、燒心、胸痛等癥狀。AT1可通過多種途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)：(1)AngⅡ通過激活A(yù)T1可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長及分化，激活磷脂酶A2，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的表達(dá)及釋放, 例如生成花生四烯酸、白三烯和血栓烷、內(nèi)皮生長因子、纖維細(xì)胞生長因子等[12]。局部促炎細(xì)胞因子的生成和釋放可使食管黏膜受損進(jìn)而導(dǎo)致食管炎的發(fā)生、發(fā)展[13]。(2)通過激活磷脂酶D，促進(jìn)磷脂酰膽堿的水解，進(jìn)而刺激細(xì)胞增殖[14]。組織增生及纖維化可降低食管的蠕動(dòng)功能，從而增加胃反流及酸清除機(jī)制受損的可能性，加重食管的損傷。(3)調(diào)控細(xì)胞膜離子通道活性，可通過激活蛋白激酶C降低黏膜電位差，進(jìn)而抑制離子的運(yùn)輸，抑制HCO3-的分泌，胃內(nèi)容物頻繁反流可引起酸負(fù)荷超載進(jìn)而導(dǎo)致食管黏膜損傷。若AT1蛋白表達(dá)升高可促使AngⅡ與AT1結(jié)合增多，可能引起局部血管收縮，通過增加局部血管張力和強(qiáng)有力的血管收縮效應(yīng)可減少胃腸道的血液供應(yīng)，考慮RE組織學(xué)最具特征表現(xiàn)，黏膜糜爛、潰瘍形成可能與此相關(guān)。

表1 AT1與Mas在RE中表達(dá)的相關(guān)性Tab 1 The correlation of the expressions of AT1 and Mas in RE

表2 AT1與Mas在BE中表達(dá)的相關(guān)性Tab 2 The correlation of the expressions of AT1 and Mas in BE

本實(shí)驗(yàn)中，無論RE組織還是BE組織中AT1表達(dá)均較正常食管黏膜明顯升高，提示食管黏膜由正常轉(zhuǎn)化為異常病變(RE、BE，甚至癌變)時(shí)，AT1蛋白可能作為血管收縮因子及促炎因子牽涉其中。如果能通過利用抑制AT1的表達(dá)或生物活性作用，或有可能阻止RE發(fā)生或發(fā)展。MIWA等[15]對(duì)在使用PPI的RE患者進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)加用AT1阻滯劑患者的治愈率得到了提高，也證實(shí)了這一推論。多重比較RE組織與BE組織中AT1的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮有以下可能：(1)AT1經(jīng)AngⅡ激活發(fā)揮生物學(xué)作用，當(dāng)AT1表達(dá)明顯升高時(shí)，AngⅡ-AT1結(jié)合可刺激更多的AT1蛋白生成，使AT1持續(xù)處于高表達(dá)水平，放大血管收縮作用及炎癥反應(yīng)。因此，當(dāng)RE、BE發(fā)生時(shí)，AT1持續(xù)高表達(dá)，引發(fā)一系列放大效應(yīng)。(2)本研究樣本量較小，存在一定的局限性，臨床研究人口規(guī)模較小且無序，考慮可能存在選擇性偏差的風(fēng)險(xiǎn)和關(guān)聯(lián)分析的不足。基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們推測AT1通過AngⅡ參與BE從正常黏膜到腸化生這一癌前病變的發(fā)生過程。有學(xué)者研究表明，AngⅡ作為RAS中的重要成分,與胰腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性[16]，那么，其與EA是否存在相關(guān)性？流行病學(xué)研究顯示，使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或AT1拮抗劑的食管癌患者發(fā)病率有所降低[17]，由此推測可能是食管黏膜局部的AngⅡ生物活性作用受到抑制的結(jié)果。綜上所述，AT1表達(dá)升高與RE的形成和發(fā)展有重要關(guān)系，推測利用抑制AT1的表達(dá)或生物活性作用，或有可能阻止RE形成及進(jìn)一步發(fā)展。

Mas蛋白由325個(gè)氨基酸組成，屬于G蛋白超偶聯(lián)受體亞家族，是Ang-(1-7)的特異性受體，Ang- (1-7)也是RAS重要組成成分之一，是ACE2的主要催化產(chǎn)物，同時(shí)也被認(rèn)為是AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子。Mas受體與Ang-(1-7)結(jié)合可發(fā)揮擴(kuò)張血管、抑制細(xì)胞増殖、抗炎和抗氧化等多種生物學(xué)功能。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，Mas由Ang-(1-7)激活，可通過內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)、血管內(nèi)皮舒張因子、前列腺素的釋放從而參與血管舒張的調(diào)節(jié)。Ang-(1-7)可能通過舒張血管為局部微脈管系統(tǒng)提供保護(hù)作用，從而改善組織供氧，增加代謝底物的排出，并能更快速地清除代謝廢物。有研究[7]顯示，當(dāng)人為阻斷Mas受體，消除Ang-(1-7)的保護(hù)作用，可引起血管收縮，組織缺血、缺氧，從而加重局部氫離子濃度，可能誘發(fā)食管黏膜損傷。有文獻(xiàn)[19]報(bào)道，Mas受體與Ang-(1-7)結(jié)合通過活化酪氨酸磷脂酶(SHP)-1，進(jìn)而抑制AngⅡ引起的P38 MAPK磷酸化作用，對(duì)細(xì)胞增殖過程可能起到一定的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)中，Mas蛋白在RE、BE組織中的表達(dá)均低于正常對(duì)照組，當(dāng)Mas表達(dá)減少時(shí)，局部微循環(huán)血流量減少，導(dǎo)致局部中性粒細(xì)胞的黏附，增加胃腸道微循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[11,18]。局部促炎細(xì)胞因子的生成和釋放可使食管黏膜受損，促使食管炎發(fā)生[20]。研究[21]表明，RE形成時(shí)，Mas受體與Ang-(1-7)結(jié)合參與食管黏膜保護(hù)機(jī)制，避免胃內(nèi)容物反流對(duì)食管黏膜的損傷。BE中的表達(dá)較RE降低，幾乎為陰性，提示Mas表達(dá)明顯減少時(shí)，其對(duì)食管黏膜的保護(hù)作用缺失，可能促使RE的形成，并發(fā)展成為BE，由此推測Mas受體激活A(yù)ng-(1-7)后，可能通過舒張食管黏膜血管、抑制上皮細(xì)胞增殖和拮抗局部炎癥反應(yīng)等途徑，對(duì)食管黏膜有一定的保護(hù)作用。綜上分析，Mas對(duì)胃腸道包括對(duì)RE損傷的黏膜可產(chǎn)生有益影響，因此合理假設(shè)Mas受體激動(dòng)劑可能作為治療RE的可行方法。

Mas受體與AT1受體分別是AngⅡ、Ang-(1-7)特異性受體，通過兩條代謝軸：ACE-AngⅡ-AT1受體軸與ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸發(fā)揮作用，且AngⅡ經(jīng)ACE2水解轉(zhuǎn)化為Ang-(1-7)，ACE2在兩個(gè)代謝軸中起到橋梁作用。其中AngⅡ-AT1發(fā)揮致病作用，Ang-(1-7)-Mas對(duì)AngⅡ所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)有拮抗作用，對(duì)組織起保護(hù)作用。Mas受體與AT1受體兩者相互拮抗，前者與Ang-(1-7)相結(jié)合起到舒張血管，改善局部組織血供，抑制細(xì)胞增生及纖維化改變的作用。文獻(xiàn)[17]報(bào)道，Mas受體與Ang-(1-7)結(jié)合抑制AngⅡ引起的P38 MAPK磷酸化作用，通過活化酪氨酸磷脂酶(SHP)-1，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用。正常情況下，由于Ang-(1-7)作用與AngⅡ相反，通過發(fā)揮相互拮抗的作用，使機(jī)體達(dá)到平衡狀態(tài)。RE發(fā)生時(shí)，Mas受體減少，則Mas與Ang-(1-7)結(jié)合減少，生物學(xué)效應(yīng)減弱，可能導(dǎo)致失平衡狀態(tài)發(fā)生，容易出現(xiàn)黏膜炎癥、缺血糜爛，甚至潰瘍等一系列病理變化。

本研究結(jié)果表明,AT1與Mas在RE組和BE組中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。已有報(bào)道Ang-(1-7)可能通過Mas受體介導(dǎo)，抑制AngⅡ激活NF-κB通路及對(duì)MMP-9的誘導(dǎo)作用，抑制其引起的慢性炎癥及增生反應(yīng)[22]。本實(shí)驗(yàn)中食管黏膜發(fā)生RE這一病理改變時(shí)，Mas表達(dá)明顯減少，則其拮抗AngⅡ- AT1結(jié)合引發(fā)的炎癥反應(yīng)的作用減弱，印證了上面的推測。當(dāng)RE發(fā)生時(shí)，Mas蛋白表達(dá)減少或缺失，推測Mas表達(dá)的減少甚至缺失會(huì)導(dǎo)致無法平衡AT1所致的慢性炎性信號(hào)通路，造成平衡失調(diào)，內(nèi)分泌紊亂，可能促使食管黏膜發(fā)生炎癥、增生、缺血、糜爛、腸化生等異常病變。國外部分學(xué)者在大鼠模型中的研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在控制食管功能、食管宏觀和微循環(huán)的激素調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[8]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

綜上所述，AT1蛋白的高表達(dá)和Mas蛋白的低表達(dá)在RE的發(fā)生、發(fā)展過程中具有密切的負(fù)相關(guān)性，二者的表達(dá)對(duì)RE的形成及發(fā)展起到一定的作用。目前考慮腎素-血管緊張素系統(tǒng)代謝產(chǎn)物可能在食管防御機(jī)制中扮演重要的角色，或可在分子生物學(xué)層面為RE發(fā)病機(jī)制的探索開辟新的方向?；谏鲜鼋Y(jié)果推測,使用血管緊張素AT1受體抑制劑、激活或放大Ang-(1-7)-Mas軸生物效應(yīng)，可能為日后對(duì)RE的治療發(fā)揮重要作用。

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