王慧穎，徐明崗，馬 想，段英華

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，耕地培育技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

土壤是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤肥力是土壤的本質(zhì)特性，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)。施肥是提高土壤肥力、維持作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，以保障糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施[1]?；手泻写罅康臓I養(yǎng)元素，化肥的施用對(duì)于提高土壤肥力，促進(jìn)糧食增產(chǎn)至關(guān)重要[2]。但在過去的幾十年里，化肥尤其含氮化肥的大量施用帶來的土壤退化、生物多樣性下降和環(huán)境污染等問題亟待解決[3]。作為養(yǎng)分更均衡的有機(jī)肥，它所釋放的穩(wěn)定、持久養(yǎng)分更利于作物的生長，然而有機(jī)肥中的養(yǎng)分釋放速度較緩慢，不能及時(shí)滿足作物生長需求。很多研究表明，有機(jī)肥與化肥的配施不僅有利于提高和穩(wěn)定土壤肥力，且可增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[4]。然而，單施化肥或有機(jī)無機(jī)肥配施下土壤肥力的演變規(guī)律及機(jī)制，尤其是生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。土壤肥力的演變，是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程，通過長期定位試驗(yàn)對(duì)土壤進(jìn)行系統(tǒng)的觀察和監(jiān)測是了解土壤肥力演變規(guī)律并探索其機(jī)制的重要和必需途徑[5-6]。20世紀(jì)80年代以來，中國科研院所和農(nóng)業(yè)大專院校陸續(xù)在不同農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)建立了一批農(nóng)田土壤肥料長期試驗(yàn)，以研究不同類型土壤和不同施肥制度條件下土壤肥力長期演變規(guī)律、肥料利用率及肥料的農(nóng)學(xué)效應(yīng)和生態(tài)環(huán)境效應(yīng)、不同水熱梯度帶農(nóng)田土壤肥力質(zhì)量和環(huán)境質(zhì)量的演變規(guī)律等，這些土壤長期定位試驗(yàn)對(duì)于研究不同施肥管理措施對(duì)農(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)的影響及其環(huán)境效應(yīng)等發(fā)揮了重要作用[7]。

作為應(yīng)用最為廣泛的管理方式，施肥通過改變土壤養(yǎng)分狀況及微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，從而影響土壤質(zhì)量、生物肥力、生產(chǎn)力以及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[8-9]。土壤中存在大量微生物，它們進(jìn)行著一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，是土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要?jiǎng)恿椭参镉行юB(yǎng)分的儲(chǔ)備庫[10-11]。土壤微生物及其控制的生物過程通過影響土壤結(jié)構(gòu)、有機(jī)物的組成以及碳、氮、磷、鉀等元素的物質(zhì)循環(huán)，從而對(duì)維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的長期穩(wěn)定具有十分重要作用[12-13]。農(nóng)田土壤中，一些重要的微生物參數(shù)如微生物數(shù)量、微生物碳氮量、酶活性、細(xì)菌真菌數(shù)量比、多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)等能夠作為判斷土壤肥力和健康狀況的指標(biāo)[14-15]。微生物群落對(duì)不同施肥處理的響應(yīng)會(huì)在時(shí)間尺度上產(chǎn)生差異，年際變化對(duì)微生物的影響不可忽略，很多驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)響應(yīng)的過程也可能隨時(shí)間減弱或增強(qiáng)[16-17]，因此研究長期定位施肥下的土壤微生物對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的影響及其驅(qū)動(dòng)因素具有重要意義。

如圖1所示，土壤養(yǎng)分與微生物是相互作用的。一方面，土壤養(yǎng)分作用于微生物：長期施肥改變土壤養(yǎng)分含量，進(jìn)而導(dǎo)致微生物的同化過程、代謝活性和群落組成發(fā)生變化[18-20]；同時(shí)土壤養(yǎng)分作為土壤酶的代謝底物，其含量的變化也會(huì)影響酶的活性[21-23]。另一方面，微生物也能作用于土壤養(yǎng)分：由于土壤微生物活性的改變引起的自身代謝、死亡和沉積等作用變化，進(jìn)而影響?zhàn)B分的積累[24-25]；而且，不同的微生物群落組成會(huì)引起微生物群落所分泌的酶及微生物生物量發(fā)生變化，從而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)[26-27]，其中功能微生物在養(yǎng)分循環(huán)中扮演重要角色。本文梳理了基于我國農(nóng)田長期定位試驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)的大量研究工作中土壤微生物學(xué)方面的研究進(jìn)展，包括土壤微生物生物量和酶活性、真菌細(xì)菌數(shù)量比例、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，并重點(diǎn)分析了參與土壤氮循環(huán)關(guān)鍵環(huán)節(jié)—氨氧化過程的氨氧化菌的研究現(xiàn)狀，討論了施肥對(duì)土壤微生物影響機(jī)制的研究現(xiàn)狀與不足，以期為土壤生物學(xué)的未來研究方向提供參考依據(jù)，為我國農(nóng)田土壤肥力的提升以及化肥和有機(jī)肥的合理施用提供理論支撐。

圖1 土壤微生物對(duì)土壤養(yǎng)分變化的響應(yīng)及反饋過程

1 長期施肥對(duì)土壤微生物量及酶活的影響

1.1 微生物數(shù)量/生物量

土壤中的微生物主要包括細(xì)菌和真菌等類群，它們在土壤肥力的形成和養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用[28-29]。土壤中微生物的數(shù)量能夠指示土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化能力和肥力高低。測定土壤微生物量的方法有許多，由最初的平板計(jì)數(shù)、之后的BIOLOGY微平板計(jì)數(shù)、磷脂脂肪酸法(PLFA)，到目前廣泛應(yīng)用的熒光定量PCR等分子學(xué)研究方法均能表示土壤微生物的數(shù)量[30]。眾多研究表明，施肥可顯著影響土壤中大多數(shù)微生物的生長發(fā)育[8-10]。通常認(rèn)為，施用化肥能提高土壤養(yǎng)分含量，進(jìn)而滿足微生物生長的養(yǎng)分需求[31]。然而，在對(duì)長期施肥下的土壤微生物數(shù)量進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，與不施化肥相比，施用化肥會(huì)顯著降低土壤微生物數(shù)量[32-33]。這可能是因?yàn)殚L期施用化肥可引起土壤酸化，而土壤pH的降低也是微生物數(shù)量減少的重要原因之一。有機(jī)肥的施用不僅能緩解由化肥引起的土壤酸化問題，而且可直接增加根系生物量及根系分泌物，為微生物繁衍提供大量的碳源，因此長期施用有機(jī)肥或有機(jī)肥與化肥的合理配施能夠顯著提高微生物的數(shù)量[34-36]。

廣義上的土壤微生物量包括土壤微生物量碳、氮、磷和硫，其中土壤微生物生物量碳(SMBC)是土壤有機(jī)質(zhì)中最為活躍的部分，可以敏感地反映出土壤有機(jī)碳的變化，是土壤生物學(xué)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一[30]；微生物生物量氮(SMBN)是土壤活性氮的重要儲(chǔ)備庫，是植物氮營養(yǎng)的重要來源[37-38]，因此，目前對(duì)微生物量的研究一般集中在微生物生物量碳和微生物生物量氮方面。與不施肥相比，均衡施用化肥能顯著提高SMBN[34,39-43]，這可能是因?yàn)槭┓屎笞魑锂a(chǎn)量的提高使得作物根茬數(shù)增加，從而為微生物提供了較多的碳源，而且化肥能直接為微生物提供大量氮源，促進(jìn)微生物對(duì)氮素的同化利用及生長。Geisseler等[43]對(duì)全球64個(gè)長期施肥試驗(yàn)點(diǎn)的107個(gè)土壤樣品進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有化肥處理均能提高微生物生物量，他認(rèn)為這是化肥處理提高了土壤中有效養(yǎng)分含量，進(jìn)而提高了微生物活性的結(jié)果。也有研究表明，長期施用化肥引起的土壤酸化及土壤碳氮比降低等問題抑制了微生物活性，不利于土壤微生物量的累積[41,44-45]。不一致的結(jié)論可能是由于所研究的土壤類型不同，而不同類型土壤的養(yǎng)分和pH值對(duì)化肥的響應(yīng)不同，從而導(dǎo)致微生物生物量對(duì)長期施用化肥的響應(yīng)不一致。盡管微生物生物量對(duì)化肥的響應(yīng)不盡相同，但施用有機(jī)肥可使之提高這一結(jié)論在各種土壤類型中均已得到證實(shí)[40-43]。與不施有機(jī)肥相比，長期施用有機(jī)肥后，紅壤的微生物生物量碳、氮分別顯著提高了25%和4%[42]；潮土的微生物生物量碳、氮分別增加了36%和130%[46]；黑土的微生物生物量碳提高了45.7%～75.2%，微生物生物量氮提高了218%～260%[47]。這是由于有機(jī)肥不僅為微生物提供了能量來源，而且各種養(yǎng)分資源較為豐富且均勻，可促使養(yǎng)分在土壤中積累進(jìn)而更利于微生物的代謝。

1.2 真菌和細(xì)菌數(shù)量比例

土壤有機(jī)物不僅是植物所需養(yǎng)分的重要來源，同時(shí)能明顯改善土壤肥力，土壤中各種來源和形態(tài)的有機(jī)物最終都必須經(jīng)過微生物分解礦化才能重新進(jìn)入土壤生物地球化學(xué)循環(huán)，因此微生物對(duì)有機(jī)質(zhì)的分解在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著巨大作用。土壤有機(jī)物的降解途徑分為真菌途徑和細(xì)菌途徑兩大類，其中真菌主要分解難分解、具有高碳氮比的有機(jī)物，此類有機(jī)物的營養(yǎng)循環(huán)時(shí)間較長，如秸稈、幾丁質(zhì)和木質(zhì)素等；細(xì)菌主要分解易被分解、有較高的碳周轉(zhuǎn)和營養(yǎng)循環(huán)速度的有機(jī)物[48]。土壤真菌/細(xì)菌數(shù)量比例(F/B)可作為反映土壤肥力和健康狀況的指標(biāo)，有研究指出較高的F/B值能夠表征微生物對(duì)周圍環(huán)境的積極響應(yīng)，代表農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)具有較高的可持續(xù)性[49-50]。

長期施用有機(jī)肥后，F(xiàn)/B值在不同類型土壤中的結(jié)果不同。長期施用有機(jī)肥后，紅壤的F/B值顯著增加[51]。其原因可能為：(1)細(xì)菌的碳氮比較低(為3～5)，而真菌的碳氮比卻高達(dá)11～13，有機(jī)肥的高碳氮比及其難分解性能刺激真菌的生長[48]；(2)有機(jī)肥中較高的含磷量更利于真菌生長,且與真菌相比，細(xì)菌對(duì)磷的響應(yīng)較弱，因此，有機(jī)肥的施用導(dǎo)致F/B值升高[52]。然而，長期施用有機(jī)肥的潮土和黑土中，F(xiàn)/B值并未發(fā)生顯著變化[21]，甚至從15顯著降低至5[50]，其原因可能為：(1)有機(jī)肥在潮土中既促進(jìn)了真菌的生長代謝，又有利于細(xì)菌中革蘭氏陰性菌的生長(革蘭氏陽性菌數(shù)量無顯著變化)，因此F/B無顯著變化[21]；(2)有學(xué)者認(rèn)為，施用有機(jī)肥利于黑土和潮土中有機(jī)質(zhì)的礦化和養(yǎng)分的循環(huán)，且細(xì)菌和真菌分別為r-策略的富營養(yǎng)菌和K-策略的貧營養(yǎng)菌，因此有機(jī)肥更利于細(xì)菌的生長繁殖，導(dǎo)致土壤F/B值降低；(3)研究表明在pH值<7范圍內(nèi)，細(xì)菌相對(duì)豐度與土壤pH值呈正比，而真菌的豐度對(duì)pH的變化并不敏感[43]。有機(jī)肥的施用通常會(huì)提高土壤pH值，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌生長[4]，所以有機(jī)肥處理下的F/B顯著下降。

1.3 酶活性

土壤酶是具有加速土壤生化反應(yīng)速率功能的蛋白質(zhì)，酶活性可反映土壤養(yǎng)分(碳、氮、磷等)轉(zhuǎn)化能力和土壤微生物活性[53]。王燦等[54]認(rèn)為土壤酶活性與施肥方式密切相關(guān)，其與作物產(chǎn)量之間的相關(guān)性優(yōu)于土壤養(yǎng)分和作物產(chǎn)量的相關(guān)性，可作為評(píng)價(jià)土壤肥力對(duì)施肥處理響應(yīng)的重要指標(biāo)。近年來，國際上對(duì)土壤質(zhì)量越來越關(guān)注，對(duì)土壤酶研究的深度和廣度不斷增加[55]。脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和過氧化氫酶為土壤中與碳、氮、磷養(yǎng)分循環(huán)及氧化還原相關(guān)的主要酶類。表1系統(tǒng)整理了與不施肥相比，施用化肥和/或有機(jī)肥后，這4種酶的變化及其主要影響因素。

表1 長期不同施肥對(duì)土壤酶活性的影響及其主要影響因素

注：△活性代表不同施肥處理與CK相比對(duì)土壤酶活性的提高或降低程度。其值為正代表提高程度，為負(fù)代表降低程度。

蔗糖酶也被稱為轉(zhuǎn)化酶，能裂解二糖分子中果糖基的β-葡萄糖苷碳原子處的鍵，使蔗糖水解為葡萄糖和果糖，可反映土壤有機(jī)碳積累、分解與轉(zhuǎn)化的規(guī)律，是評(píng)價(jià)土壤熟化程度和肥力水平的指標(biāo)[55-56]。一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。由表1可見，化肥和有機(jī)肥處理均能顯著提高蔗糖酶的活性[35,54,57]，其中有機(jī)肥最高可提高蔗糖酶活性至3.2倍[57]?；手阅芴岣咄寥勒崽敲富钚?，是因?yàn)榕c不施肥相比，肥料中的養(yǎng)分施入后更利于土壤養(yǎng)分比例的調(diào)節(jié)，為有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化提供有利環(huán)境[55]。有機(jī)肥提高蔗糖酶活性的原因是其提供了大量的轉(zhuǎn)化酶的誘導(dǎo)物—有機(jī)質(zhì)，為蔗糖酶提供了更豐富的酶促機(jī)制，從而為微生物活動(dòng)和酶活性的提高創(chuàng)造了有利條件[57]。

脲酶是指示土壤氮循環(huán)過程的重要酶類，可將有機(jī)物中的碳-氮鍵水解生成氨、二氧化碳和水，促進(jìn)有機(jī)氮向礦質(zhì)氮的轉(zhuǎn)化[55]，其活性與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量呈正相關(guān)。由表1可見，施用不同肥料均可不同程度地提高土壤脲酶活性，其中施用化肥能提高25%～117%，化肥配施有機(jī)肥可提高67%～280%[57]。另外，對(duì)長期施肥下封丘潮土脲酶活性的分析發(fā)現(xiàn)，其年際變化規(guī)律在不同施肥處理間亦不同，施用化肥處理的土壤脲酶活性隨時(shí)間沒有明顯變化，而有機(jī)肥處理下土壤脲酶活性隨施肥年份的增加顯著提高[57]。

磷酸酶能夠催化土壤中磷酸單酯和磷酸二酯水解，指示有機(jī)磷向有效磷的轉(zhuǎn)化過程。磷酸酶是一種適應(yīng)性酶，土壤含磷量的差異會(huì)導(dǎo)致不同土壤類型下的磷酸酶活性對(duì)施肥的響應(yīng)不同[58]。如，由于不施肥的北京褐潮土的供磷能力較低，有機(jī)磷需礦化才能滿足作物所需，而有機(jī)磷礦化則會(huì)刺激作物根系分泌較多磷酸酶，因此在不施肥的褐潮土中磷酸酶含量較高，反而由于長期施用化肥處理的土壤含磷量能滿足作物所需，故無需分泌較多磷酸酶，因此其磷酸酶活性降低[59]。相反，在不施肥情況下，河南封丘潮土中的磷足夠滿足作物需求，長期施用化肥使其含磷量更高，此時(shí)需要更多的磷酸酶將磷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，故長期施用化肥的潮土的磷酸酶提高了40%～103%(表1)。一般來說，磷酸酶又被分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，這兩種酶的活性受土壤pH的顯著影響。王燦等[54]在對(duì)湖北水稻土的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于此試驗(yàn)區(qū)土壤偏堿性，故所有施肥處理的堿性磷酸酶的活性顯著高于酸性磷酸酶活性；他還發(fā)現(xiàn)，土壤pH的降低使得酸性磷酸酶含量提高了98%，而堿性磷酸酶含量降低了16%。

脫氫酶屬于氧化還原酶體系，反應(yīng)中稱被氧化的底物為氫供體或電子供體[60-61]。當(dāng)被氧化的底物為過氧化氫時(shí)，也可將之稱為過氧化氫酶。研究認(rèn)為，細(xì)菌、真菌以及植物根系所分泌的過氧化氫會(huì)對(duì)植物以及土壤產(chǎn)生毒害，過氧化氫酶的存在能減弱過氧化氫的毒害作用[61]。不同類型土壤的脫氫酶活性不同，其原因主要有兩點(diǎn)：一、脫氫酶活性與土壤通氣性和土壤質(zhì)地相關(guān)，一般認(rèn)為，砂礫含量較高、通氣性較好的土壤利于其氧化還原電位(Eh)和自身氧化能力的提高，但脫氫酶底物也會(huì)因此減少，故此時(shí)會(huì)降低脫氫酶的活性；二、不同類型土壤的脫氫酶底物含量的差異較大，脫氫酶活性與土壤中的底物含量呈正比。同時(shí)，脫氫酶活性在不同土壤類型下對(duì)施肥處理的響應(yīng)也不一致。對(duì)于部分類型土壤，脫氫酶和過氧化氫酶活性在長期有機(jī)肥或/和化肥施用下顯著高于不施肥處理下的活性(表1)[57,60]；但對(duì)于北京潮土，長期施肥導(dǎo)致過氧化氫酶活性降低10%～97%[56,59]，這可能由于未施肥的潮土中含有大量電子供體，而施肥后電子供體減少所致。大量研究表明土壤pH值也是影響過氧化氫酶活性的重要因子。Sun等[62]在對(duì)紅壤、紫砂壤以及灰漠土中的過氧化氫酶進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，長期化肥處理的灰漠土及紅壤pH值的降低導(dǎo)致過氧化氫酶活性被抑制，而pH值無顯著變化的紫砂壤的過氧化氫酶活性并無明顯改變。這可能是由于土壤pH值下降會(huì)刺激還原反應(yīng)的進(jìn)行，因此過氧化氫酶活性下降[63]。

2 長期施肥對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

2.1 細(xì)菌數(shù)量

細(xì)菌約占土壤微生物數(shù)量的70%～90%，它不但參與土壤有機(jī)物與無機(jī)物的轉(zhuǎn)化，而且在維持整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[64]。大量研究表明土壤中的細(xì)菌數(shù)量主要受pH值及碳、氮、磷等養(yǎng)分含量的影響[19]。其中，長期施用氮肥不僅可顯著降低土壤pH值，也會(huì)造成土壤養(yǎng)分不均衡，因此顯著降低土壤中細(xì)菌的數(shù)量[65]。磷也是影響細(xì)菌生長的重要因素，與無磷處理相比，含磷處理的紅壤中細(xì)菌數(shù)量顯著提高[15]。長期施用養(yǎng)分均衡的化肥能滿足細(xì)菌的養(yǎng)分需求，會(huì)顯著提高細(xì)菌數(shù)量[11,15,65]。長期有機(jī)肥化肥配施不僅有利于土壤有機(jī)碳的累積，且可使土壤pH值保持在7左右，故此時(shí)的細(xì)菌數(shù)量顯著高于不施肥和化肥處理[32-34,66]。另外，由于有機(jī)肥中含有大量能直接供細(xì)菌生長的養(yǎng)分和能源，因此配施肥中有機(jī)肥所占比例也能顯著影響細(xì)菌的含量[51]，如化肥配施60%有機(jī)肥的處理下土壤細(xì)菌數(shù)量顯著高于配施30%有機(jī)肥的處理[33]。

2.2 細(xì)菌多樣性

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，細(xì)菌的多樣性與土壤質(zhì)量、作物產(chǎn)量及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)[12]。有學(xué)者認(rèn)為由于土壤環(huán)境的改變導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性發(fā)生了變化，細(xì)菌多樣性也因此受到影響[26]，長期不同施肥處理導(dǎo)致土壤理化性狀等發(fā)生了顯著變化，進(jìn)而影響了細(xì)菌的多樣性。一般認(rèn)為，均衡施肥為細(xì)菌提供的均衡養(yǎng)分能滿足各類細(xì)菌的生長和代謝，故多樣性顯著提高[67]。而由于長期只施氮肥會(huì)促進(jìn)與氮循環(huán)相關(guān)的細(xì)菌的生長代謝，此時(shí)其它養(yǎng)分的不足會(huì)抑制對(duì)這些養(yǎng)分需求量較大的細(xì)菌的生長，因此細(xì)菌多樣性指數(shù)明顯降低[8,64,67]。一般認(rèn)為，有機(jī)物料比化肥更能為微生物提供全面且充足的營養(yǎng)，對(duì)大多數(shù)微生物生長代謝具有良好的刺激作用，使得細(xì)菌的均勻度和多樣性指數(shù)更高[32]。然而，Ge等[18]對(duì)封丘砂壤的研究發(fā)現(xiàn)，長期施用有機(jī)肥雖能提高細(xì)菌多樣性指數(shù)，但卻顯著降低了細(xì)菌均勻度指數(shù)，這可能是因?yàn)椴煌寥李愋拖碌募?xì)菌種類對(duì)有機(jī)肥的利用率不同，封丘砂壤中的不同種類細(xì)菌對(duì)有機(jī)肥的利用率差異較大，導(dǎo)致其細(xì)菌均勻度指數(shù)下降。也有學(xué)者認(rèn)為微生物多樣性指數(shù)提高的原因一方面是只增加了微生物的種類，另一方面是只豐富了某一細(xì)菌種群的多樣性[18,68]，由此可見，Ge等[18]的分析結(jié)果中多樣性指數(shù)增加而均勻度指數(shù)降低的原因?qū)儆诤笳摺?/p>

除土壤養(yǎng)分含量外，細(xì)菌的多樣性與土壤pH值的相關(guān)性更高。一般情況下，土壤pH值在7左右時(shí)，適合大多數(shù)細(xì)菌的生長，多樣性指數(shù)也最高。眾多研究結(jié)果表明化肥處理會(huì)顯著降低細(xì)菌的群落多樣性[69]，這可能就是由于化肥處理引起了土壤酸化，絕大部分細(xì)菌的活性也因此被抑制所致。施用有機(jī)肥能中和含氮化肥導(dǎo)致的土壤酸化，進(jìn)而提高細(xì)菌的多樣性[64]。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

生態(tài)對(duì)策也稱為生活史對(duì)策，是指生物在進(jìn)化過程中對(duì)其某些特定的生態(tài)壓力所采取的生活史或行為模式，土壤中不同微生物的r-和K-選擇連續(xù)體作為土壤生態(tài)對(duì)策，分別用富營養(yǎng)類群(Copitroph)和貧營養(yǎng)類群(Oligotraph)描述r-選擇者和K-選擇者[70]。其中富營養(yǎng)類群能夠有效消耗土壤易降解碳庫，對(duì)養(yǎng)分要求較高，生長速率較高，主要包括變形桿菌(Proteobacteria)中的大部分類群和放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)等；而貧營養(yǎng)類群可消耗難降解的有機(jī)碳庫，雖生長速率較慢，但是卻具有較高的養(yǎng)分親和力，主要包括酸桿菌(Acidobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)等[71-72]。研究表明，由于富營養(yǎng)類群和貧營養(yǎng)類群不同的生長特性，富營養(yǎng)類群對(duì)土壤氮素的需求量比貧營養(yǎng)類群大，因此富營養(yǎng)類群需要生活在碳氮比較低的富營養(yǎng)環(huán)境中[71-72]。長期定位施肥可通過不斷改變微生物所需的碳氮資源，從而顯著改變細(xì)菌群落組成[73]，富營養(yǎng)細(xì)菌類群和貧營養(yǎng)細(xì)菌類群也會(huì)隨之發(fā)生顯著變化，因此其相對(duì)豐度可作為指示和預(yù)測土壤養(yǎng)分的微生物指標(biāo)之一。通過研究長期施肥下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及其驅(qū)動(dòng)因子，能夠?yàn)槿绾稳藶檎{(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的微生物區(qū)系提供理論依據(jù)。

有關(guān)長期不施肥、施用化肥和有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究，我國近些年在紅壤、潮土和黑土等典型農(nóng)田土壤中取得了突破性的進(jìn)展。圖2總結(jié)了長期不同施肥下，8種主要細(xì)菌門類在哈爾濱黑土(HEB)、鄭州潮土(ZZ)、常熟黏土(CS)和祁陽紅壤(QY)中的變化。不同肥料能通過改變土壤中的碳氮養(yǎng)分驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落向富營養(yǎng)型或貧營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變。在ZZ、CS和QY 3種土壤中施用有機(jī)肥(M或NPKM處理)均能提高富營養(yǎng)類群Bacteriodetes和Proteobacteria的豐度，同時(shí)根據(jù)Fierer等[74]所提出的富營養(yǎng)類群集中在有機(jī)碳礦化速率較快的環(huán)境中的理論，推斷長期施用有機(jī)肥提高了土壤中有機(jī)碳的礦化速率，有利于改善土壤肥力。而在這3種類型土壤中，貧營養(yǎng)類群Acidobacteria對(duì)有機(jī)肥的響應(yīng)不完全一致：ZZ中顯著提高、CS中無顯著變化、QY中顯著降低，這可能由于供貧營養(yǎng)類群利用的難降解有機(jī)碳含量在不同土壤類型中的含量有所差異。Fierer等[74]發(fā)現(xiàn)添加氮源同時(shí)利于農(nóng)田和草地兩個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中富營養(yǎng)類群Proteobacteria和Bacteriodetes的生長，不利于貧營養(yǎng)類群Acidobacteria的生長。然而，我國學(xué)者的研究結(jié)果與Fierer等[74]的結(jié)果不盡相同：Bacteriodetes的豐度在ZZ、CS和QY中顯著提高，而在HEB中無顯著變化；Proteobacteria在HEB和ZZ土壤中顯著提高，在另兩個(gè)土壤中無顯著變化；Acidobacteria在HEB和CS中被顯著降低，在QY中被提高，而在ZZ中無顯著變化。由此可見，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌群落對(duì)化學(xué)氮肥的響應(yīng)會(huì)因土壤類型不同而產(chǎn)生差異。

圖2 長期不同施肥處理下主要細(xì)菌門類的豐度

注：HEB、ZZ、CS和QY分別代表哈爾濱黑土、鄭州潮土、常熟黏土和祁陽紅壤。CK為不施肥處理；N、NP和NPK為化肥處理，其中LN、LNHP和LNPK代表低量化肥處理，HN、HNHP和HNPK代表高量化肥處理；M為有機(jī)肥處理；NPKM為有機(jī)無機(jī)混施肥處理?？v坐標(biāo)代表每種菌的序列數(shù)占序列總數(shù)的百分比。HEB、ZZ、CS和QY數(shù)據(jù)分別源自Zhou等[75]、Li等[76]、Zhao等[67]和Xun等[77]。

除土壤中的碳氮養(yǎng)分能驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化外，pH值是影響微生物群落的另一關(guān)鍵因子[78]，且pH能夠很好地預(yù)測細(xì)菌群落組成[75]。土壤細(xì)菌群落之所以受pH的驅(qū)動(dòng)，是因?yàn)榧?xì)菌的主要菌群受pH的影響較大[79]。如，Xun等[77]研究表明細(xì)菌群落中受pH影響較大的優(yōu)勢菌種為Firmicutes和α-Proteobacteria，且它們均與土壤pH顯著正相關(guān)，在添加有機(jī)肥的土壤中豐度較高；Zeng等[80]發(fā)現(xiàn)，隨施氮量增加引起的pH下降導(dǎo)致Acidobacteria、α-Proteobacteria、Bacteroidetes以及Chloroflexi的豐度降低，而Actinobacteria及β-Proteobacteria的結(jié)果與之相反。同時(shí)，土壤微生物又是土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要?jiǎng)恿?，如Actinobacteria為分解有機(jī)物的主要細(xì)菌類群[74,81]，Proteobacteria中含有大量參與土壤氮循環(huán)的種群[82]，Chloroflexi中的Anaerolineae具有分解復(fù)雜有機(jī)物的能力[83-84]。因此可通過施肥將土壤調(diào)節(jié)為利于有益菌群生長代謝的pH值和養(yǎng)分環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控土壤肥力。

3 長期施肥對(duì)氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的影響

氮的存在形態(tài)顯著影響作物生長，作物對(duì)氮肥的需求是否得到滿足基本決定了作物產(chǎn)量的高低。土壤中氮素形態(tài)的轉(zhuǎn)化主要包括無機(jī)氮的固定、有機(jī)氮的氨化、銨態(tài)氮的硝化及硝態(tài)氮的反硝化4個(gè)過程，且均由微生物驅(qū)動(dòng)。其中，銨態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮的過程被稱為硝化過程。由于植物可利用氮素的形態(tài)僅有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，因此硝化作用在很大程度上影響了土壤氮素對(duì)作物的有效性[83]。同時(shí)，硝化作用也是連接固氮作用與反硝化作用的中間環(huán)節(jié)，而反硝化的產(chǎn)物N2O占生物圈釋放到大氣中N2O總量的70%～90%[84-85]，因此硝化作用還與過量氮肥投入導(dǎo)致的環(huán)境問題直接相關(guān)，被認(rèn)為是氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。

氨氧化作用也稱亞硝化作用，是硝化作用的第一個(gè)反應(yīng)步驟，同時(shí)也是限速步驟，是全球氮循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，參與此過程的主要微生物為氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)，它們被認(rèn)為是研究土壤微生物生態(tài)學(xué)的模式生物[86]，其群落結(jié)構(gòu)變化可更有效表征土壤理化性狀的改變[10,87]。因此，AOA和AOB一直是研究硝化速率限制因素、N2O產(chǎn)生機(jī)制及環(huán)境的改變?nèi)绾斡绊懝δ芪⑸锏葐栴}的熱點(diǎn)。近些年在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的研究中，有關(guān)氨氧化菌對(duì)長期施肥響應(yīng)的關(guān)注度越來越高。

施用氮肥不僅能夠改善土壤中氮素的有效性，提高土壤微生物的硝化能力和硝化速率，同時(shí)也會(huì)改變與硝化過程密切相關(guān)的AOA和AOB的群落[9-10,87-88]。長期施用氮肥可顯著降低紅壤和黃棕壤中AOA和AOB的數(shù)量，這可能是氮肥導(dǎo)致土壤酸化，也可能是長期施用氮肥導(dǎo)致土壤養(yǎng)分不均衡，因此不利于氨氧化菌的生長[9-10]。Chu等[19]對(duì)潮土的研究發(fā)現(xiàn)，長期施用氮肥，AOB的多樣性明顯高于不施肥處理，由此可見,氮肥的施用雖會(huì)降低部分土壤中AOB的豐度，但又能滿足各種氨氧化細(xì)菌對(duì)氮素的需求，因此多樣性顯著提高。通過比較施用化肥和有機(jī)無機(jī)肥配施下的硝化微生物，學(xué)者認(rèn)為硝化微生物活性受無機(jī)氮肥的影響更大[89-90]，且研究發(fā)現(xiàn)長期施用化學(xué)氮肥使得Nitrosospiracluster3成為AOB的優(yōu)勢菌種[10,19]。然而，以上結(jié)論均通過長期定位試驗(yàn)獲得，與短期試驗(yàn)結(jié)果不盡相同。短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，添加氮肥4周[91]、6周和8周[92]后均未發(fā)現(xiàn)AOB群落的顯著改變。

amoA基因是編碼氨氧化酶的α-亞族，由于其核苷酸序列被完整地保存，同時(shí)具有產(chǎn)生能量代謝的基本特征，故被作為研究AOA和AOB的標(biāo)志基因[93]。長期施用有機(jī)肥可顯著提高土壤中amoA基因的表達(dá)量，據(jù)此可推測長期施用有機(jī)肥能夠提高土壤中AOA和AOB的數(shù)量[94]。也有研究發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥不僅能夠提高土壤中AOA和AOB的數(shù)量，也能影響其群落組成[93-95]。研究表明，不均衡化肥處理下的AOA序列被分到clusterM組，且與貧營養(yǎng)環(huán)境下的AOA序列相似，而均衡化肥及有機(jī)肥處理下的AOA序列被分到clusterS一組[95]。然而，氨氧化菌在不同類型土壤中對(duì)施肥的響應(yīng)并不一致：與長期不施肥和施用化學(xué)氮肥相比，向氮肥中加入有機(jī)肥后顯著改變了河南潮土[19]、黑壚土[96]和石灰性紫色土[97]中的AOB的群落結(jié)構(gòu)，但AOB群落在湖南紅壤的所有處理中無顯著變化，且在不同處理下的AOB序列的相似度高達(dá)98%[10]。

4 展望

4.1 加強(qiáng)長期定位試驗(yàn)中微生物過程的聯(lián)網(wǎng)研究

土壤微生物指標(biāo)很容易受人為活動(dòng)干擾，施肥對(duì)其影響較大，如何深入研究微生物對(duì)不同施肥方式的響應(yīng)及其影響因素這一問題亟待解決。長期定位試驗(yàn)不僅能夠準(zhǔn)確反映不同施肥處理下土壤微生物數(shù)量、活性、多樣性以及土壤肥力變化，還能通過時(shí)間序列的變化來反映微生物如何驅(qū)動(dòng)土壤肥力變化。綜合長期施肥對(duì)微生物群落和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變，能預(yù)測不同施肥對(duì)微生物的影響及其驅(qū)動(dòng)因素。由長期施用含氮化肥所帶來的土壤酸化和養(yǎng)分不均衡等土壤環(huán)境引起的微生物數(shù)量及活性顯著下降，微生物多樣性降低等問題，足夠從生物學(xué)角度證明長期施用含氮化肥會(huì)破壞農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，且不利于土壤肥力的提升。然而，長期有機(jī)肥與含氮化肥配施所引起的積極的生物學(xué)效應(yīng)證明合理配施有機(jī)肥是當(dāng)前農(nóng)田保肥穩(wěn)產(chǎn)，生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定發(fā)展的最佳選擇。

然而，當(dāng)前有關(guān)長期施肥對(duì)土壤微生物的大部分研究只在某一特定長期定位點(diǎn)進(jìn)行。研究表明，不同土壤類型及不同區(qū)域氣候下的土壤微生物對(duì)長期施肥的響應(yīng)不同，如，在處于亞熱帶季風(fēng)氣候的紅壤中長期施用化肥降低土壤F/B值，也會(huì)顯著提高酸桿菌(Acidobacteria)的相對(duì)豐度，但在處于溫帶大陸性季風(fēng)氣候的黑土中長期施用化肥的結(jié)果恰與之相反。上文已提及有機(jī)肥利于富營養(yǎng)類群的生長，而化肥對(duì)來自不同點(diǎn)位的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響卻不一致。因此，結(jié)合多點(diǎn)位的氣候變化及土壤差異等因素，在大尺度上綜合研究微生物對(duì)長期施肥的響應(yīng)規(guī)律有待深入挖掘。對(duì)于普遍規(guī)律的探索，應(yīng)考慮將微生物數(shù)據(jù)與更佳的數(shù)學(xué)模型相結(jié)合，對(duì)全國長期定位施肥點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)網(wǎng)研究，將肥料—環(huán)境因子—微生物三者建立定性和定量的數(shù)學(xué)模型，研究結(jié)果將為如何在全國所有氣候下不同類型的土壤中有效施肥提供更可靠的理論依據(jù)。

4.2 加強(qiáng)對(duì)功能菌及其對(duì)養(yǎng)分循環(huán)過程的調(diào)控研究

如今對(duì)長期施肥下功能微生物的研究大多集中在碳、氮循環(huán)的某個(gè)或某些特定微生物功能基因，因此會(huì)弱化其他微生物功能基因在驅(qū)動(dòng)整個(gè)養(yǎng)分循環(huán)中的作用。若想更深入理解驅(qū)動(dòng)土壤養(yǎng)分循環(huán)的微生物因子，應(yīng)全面分析參與養(yǎng)分循環(huán)的功能基因，將田間試驗(yàn)與室內(nèi)培養(yǎng)相結(jié)合，采用原位技術(shù)，如同位素標(biāo)記等手段將功能基因與施肥措施以及土壤養(yǎng)分、植物生理生態(tài)過程之間建立耦合關(guān)系，進(jìn)而為合理施肥提供更完善的理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，利用同位素標(biāo)記和定量PCR等方法，將參與養(yǎng)分循環(huán)的功能基因與其作用的底物、產(chǎn)物及土壤環(huán)境相結(jié)合進(jìn)行定量研究，進(jìn)一步定量闡述影響各類功能基因的因子及各功能基因如何調(diào)控整個(gè)養(yǎng)分循環(huán)過程。如，在研究氮循環(huán)過程時(shí)，將整個(gè)氮循環(huán)的功能基因豐度與氮肥利用率相結(jié)合，進(jìn)一步定量闡述施肥如何影響各類氮循環(huán)相關(guān)基因及各功能基因如何調(diào)控整個(gè)氮循環(huán)及氮肥利用過程。研究結(jié)果以功能菌和功能基因?yàn)闃屑~，建立肥料—土壤因子—功能基因/功能菌—養(yǎng)分利用率的相關(guān)定量模型，為養(yǎng)分的管理提供反饋或者建議，這樣才能真正發(fā)揮功能菌和功能基因?qū)τ行┓实闹笇?dǎo)性作用。

4.3 加強(qiáng)對(duì)真菌和原生動(dòng)物及其調(diào)控養(yǎng)分循環(huán)過程的機(jī)制研究

除細(xì)菌外，作為微生物重要組成部分的真菌和原生動(dòng)物也是土壤養(yǎng)分的主要調(diào)控者。真菌是土壤中復(fù)雜有機(jī)物的主要分解者，其微生物量及其分泌物具有重要的土壤碳匯功能；原生動(dòng)物及在根際廣泛分布的菌根真菌在土壤碳氮養(yǎng)分的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。但由于目前真菌序列的測試精度較低、分類不健全，研究原生動(dòng)物的方法受限，導(dǎo)致對(duì)真菌和原生動(dòng)物的群落組成及每個(gè)物種在農(nóng)田土壤中發(fā)揮的具體作用仍認(rèn)識(shí)不足。因此，與集中于細(xì)菌群落的大量研究相比，有關(guān)長期施肥對(duì)真菌群落和原生動(dòng)物的影響及它們對(duì)農(nóng)田土壤養(yǎng)分的調(diào)控的研究尚待加強(qiáng)。另外，細(xì)菌、真菌及原生動(dòng)物的交互作用也不容忽視，如它們對(duì)養(yǎng)分的競爭作用、在養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和運(yùn)移過程中的協(xié)助關(guān)系、原生動(dòng)物對(duì)細(xì)菌的捕食等也在很大程度上影響整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分調(diào)節(jié)。因此，今后的研究應(yīng)更多地關(guān)注如何改進(jìn)對(duì)原生動(dòng)物及真菌的研究和分類方法，加強(qiáng)對(duì)真菌和原生動(dòng)物的認(rèn)識(shí)，這樣有助于更深入地揭示土壤微生物對(duì)長期施肥農(nóng)田土壤的響應(yīng)及微生物在養(yǎng)分循環(huán)過程中的交互作用。

4.4 提高土壤微生物學(xué)研究對(duì)生產(chǎn)的實(shí)際指導(dǎo)意義

目前，對(duì)土壤酶、生物量、多樣性、群落結(jié)構(gòu)的研究方法與技術(shù)均日漸成熟。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從基因水平入手，通過對(duì)微生物遺傳物質(zhì)的分析，能更客觀地反映自然環(huán)境中微生物生態(tài)多樣性的狀況。尤其高通量測序技術(shù)和基因探針技術(shù)的出現(xiàn)，不斷刷新人們對(duì)土壤微生物這一“生物暗物質(zhì)”的認(rèn)識(shí)，使得深入挖掘土壤微生物資源，定量描述土壤微生物參與的養(yǎng)分循環(huán)貢獻(xiàn)過程和定向調(diào)控微生物功能成為可能。但是，當(dāng)前對(duì)現(xiàn)代分析生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用只停留在通過此技術(shù)刷新對(duì)土壤微生物認(rèn)識(shí)的階段，只有進(jìn)一步探究不同土壤微生物的功能特性及其生態(tài)位點(diǎn)，并將其與土壤養(yǎng)分循環(huán)及作物對(duì)養(yǎng)分吸收利用相結(jié)合，才能將此技術(shù)的研究成果更有效地應(yīng)用到實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

例如，現(xiàn)階段對(duì)氨氧化菌這一參與硝化過程的關(guān)鍵微生物的研究已成為探索氮循環(huán)的熱點(diǎn)。雖已有大量關(guān)于不同施肥如何影響氨氧化菌的研究成果，但如何將這些研究結(jié)論應(yīng)用到有效改善由于施肥導(dǎo)致的氮肥利用率低、環(huán)境惡化等問題中應(yīng)加以重視。通過對(duì)氨氧化菌在不同施肥環(huán)境下對(duì)硝化作用的貢獻(xiàn)及硝化抑制劑的研究將有助于解決以上問題。同時(shí)，早在19世紀(jì)末Sergei Winogradsky提出硝化過程分為上述的亞硝化作用和硝化作用，分別由氨氧化菌(ammoniaoxidizer)及亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(nitriteoxidizingbacteria)完成。然而最新研究發(fā)現(xiàn)3種不同培養(yǎng)細(xì)菌[104-105]和一種非培養(yǎng)細(xì)菌能夠各自進(jìn)行從氨氮到硝態(tài)氮的完全硝化過程，此種群被稱之為完全氧化菌(Comammox)，且這3種細(xì)菌都屬于Nitrospira，但在此之前Nitrospira一直被認(rèn)為只能完成亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮這一步驟。這一發(fā)現(xiàn)打破了以往對(duì)硝化作用的認(rèn)識(shí)，如果能篩選出高效優(yōu)勢的完全氧化菌菌種，可能會(huì)顛覆對(duì)相關(guān)問題的研究。

綜上，從提高細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物在調(diào)節(jié)養(yǎng)分過程的交互作用的關(guān)注度，加強(qiáng)長期定位試驗(yàn)中微生物過程的聯(lián)網(wǎng)研究，深入探究功能菌及其對(duì)養(yǎng)分循環(huán)過程的調(diào)控，提高土壤微生物學(xué)研究對(duì)生產(chǎn)的實(shí)際指導(dǎo)意義這幾方面著手，深入對(duì)長期施肥下土壤微生物的研究，建立相應(yīng)的施肥—土壤—微生物的定量模型，才能利用微生物為科學(xué)施肥提供更可靠的理論依據(jù)，同時(shí)為其在土壤學(xué)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提出更合理的建議。

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