董煒靈，尹華群*，劉學端，宋阿琳，范分良*

(1.中南大學資源加工與生物工程學院，湖南 長沙 410000；2.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所/農業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081)

近年來，全球氣候變化在改變生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能方面已經發(fā)揮了越來越重要的作用。由于土壤微生物群落介導了絕大多數土壤功能過程，因而氣候變化所導致的溫度上升會通過影響微生物群落結構和活性進而間接影響土壤功能[1-2]，其中包括土壤營養(yǎng)物質的流動和碳氮等元素的生物地球化學循環(huán)[3-5]。然而，鑒于土壤微生物群落高度復雜的多樣性，目前人們還難以了解溫度升高是如何影響土壤微生物群落的結構和功能以及其對土壤生態(tài)系統(tǒng)的反饋[6]。相比于植物和動物對于溫度變化的響應，微生物在這方面的研究相對要少一些，而真菌比細菌則更少。微生物中真菌更偏向于降解那些以難降解碳形式居多的有機碳化合物[7]。微生物群落豐度在溫度轉變下所發(fā)生的變化反映出其溫度敏感性，研究真菌群落的溫度敏感性有助于了解土壤中難降解碳的降解情況和趨勢。

另一方面，人類活動例如牧場和農田的建立，或者人工造林都會對土壤性質產生不同程度的影響[8]。而土壤性質的改變可能關聯(lián)到土壤微生物的溫度敏感性。然而，對于改變土壤性質對土壤微生物溫度敏感性產生影響的相關研究還很少。本研究以湖南省祁陽縣兩種不同性質的紅壤為研究對象，利用伽馬射線滅菌和土壤互相接種的方式探討改變土壤性質對土壤真菌溫度敏感性的影響，旨在為全球氣候變暖情況下不同土壤溫度敏感性相關研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自湖南省祁陽縣中國農業(yè)科學院試驗站(26°45′12″ N，111°52′32″ E)，成土母質為第四紀紅土，年平均氣溫18℃，年降水量1 250 mm。其中自然土壤取自長期定位施肥試驗田附近，農田土壤取自長期定位施肥試驗田。供試土壤的主要化學性質見表1。

表1 供試土壤的主要化學性質

1.2 試驗設計

以往研究表明，盡管伽馬射線滅菌可能提高土壤銨態(tài)氮濃度，但其對土壤性質的總體影響比高溫高壓滅菌等其它滅菌方法的影響要小[9]，故本研究利用伽馬射線將兩種性質的土壤(自然土和農田土)滅菌，滅菌劑量為40 kGy。然后分別裝袋，每袋土為1.4 kg。后將100 g未滅菌的土壤(自然土和農田土)分別裝入已滅過菌的不同性質土壤(自然土和農田土)中。其中，滅菌土壤提供特定的土壤性質(一種是未施肥處理性質的土壤，另一種是經過長期施肥處理性質的土壤)，而未滅菌土壤提供兩種土壤特定的微生物。因此，本試驗分為4個處理：(1)未滅菌自然菌+滅菌自然土，(2)未滅菌自然菌+滅菌農田土，(3)未滅菌農田菌+滅菌農田土，(4)未滅菌農田菌+滅菌自然土。本試驗主要研究：(1)自然土壤微生物在自然和農田兩種土壤性質下溫度敏感性對比；(2)農田土壤微生物在農田和自然兩種土壤性質下溫度敏感性對比。將土壤混勻后用無菌濾膜密封，以防微生物污染，但可以流通空氣，然后放于20℃預培養(yǎng)一個月。

預培養(yǎng)結束后，將30 g土壤分裝于125 mL血清瓶中，分別于15和25℃正式培養(yǎng)20 d。分別在培養(yǎng)的第2、5、10、15 d打開蓋子，讓瓶內氣體與室內環(huán)境氣體換氣5 min。20 d后，破壞性取樣，把土壤存放于-80℃冰箱。

1.3 測試方法

1.3.1 土壤DNA的提取

采用DNA提取試劑盒FastDNA spin kit for soil(MP Biomedicals)，按照說明書的步驟操作。

1.3.2 定量PCR擴增

擴增真菌18S rDNA的引物為真菌通用引物FF390和FR1，它們的序列為：

FF390：5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′和FR1：5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′

反應體系見表2。

表2 總體積15 μL的定量PCR擴增反應體系

PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃解鏈10 s，52℃退火30 s；72℃延伸45 s；40個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.3 普通PCR

擴增真菌ITS DNA采用兩輪擴增法，第一輪引物為真菌通用引物ITS1F和ITS4，第二輪引物為真菌通用引物ITS4和帶有barcode的引物ITS3，它們的序列為：

ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′

ITS3：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′

反應體系見表3。

表3 總體積25 μL的普通PCR擴增反應體系

第一輪PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃解鏈45 s，50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

第二輪PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃解鏈45 s，50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產物跑1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 PCR擴增產物切膠純化和回收

PCR擴增產物的純化和回收，使用天根DNA切膠純化試劑盒，按照說明書的步驟操作。

1.3.5 高通量測序

采用Illumina第二代測序技術平臺。

1.4 分析工具與方法

1.4.1 分析工具

高通量序列用USEARCH軟件包分析，首先去除質量數低于20的序列，然后去除與引物不一致的序列；所得到的高質量序列統(tǒng)一保留250 bp，用UPARSE進行聚類，相似度大于97%的序列定義為一個分類操作單元(OTU)；嵌合體用UCHIME去除；采用Excel 2010與SPSS 20軟件進行數據統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVO進行方差分析不同時間點微生物相對豐度的差異(P<0.05)。

1.4.2 分析方法

溫度敏感真菌的分析：尋找受溫度影響較大的真菌個體，以OTU為單位的相對豐度變化為依據，引入“溫度響應”的概念[9]。溫度響應=25℃真菌相對豐度-15℃真菌相對豐度。在兩個溫度下真菌相對豐度都為0的OTU不參與統(tǒng)計。在相對豐度有顯著性差異(P<0.05)的前提下，溫度響應值為正值的稱為熱響應真菌，負值的稱為冷響應真菌，統(tǒng)稱為溫度敏感真菌。選出這些熱響應或冷響應的OTU后再按照“目”分類水平歸類。另一方面，把所有真菌按照“目”分類水平歸類后比較哪些菌目受到溫度變化影響較大，菌目名后綴為_In_se表示分類未確定，表征公式為：相對豐度變化=log10[(25℃相對豐度-15℃相對豐度)/15℃相對豐度×100]。只取相對豐度大于0.05%的菌目參與比較。正值表示相對豐度隨溫度上升而增加，負值表示相對豐度隨溫度上升而減少。

2 結果與分析

2.1 土壤性質對真菌群落總豐度溫度敏感性的影響

從圖1結果可看出，真菌群落總豐度的變化范圍為3.35×107～1.99×108個·g-1土。在自然土壤中，自然土壤的真菌升溫后總豐度降低了13.48%；在改變?yōu)檗r田土壤后，自然土壤的真菌升溫后總豐度降低了3.57%。在農田土壤中，農田土壤的真菌升溫后總豐度增加了15.66%；在改變?yōu)樽匀煌寥篮?，農田土壤的真菌升溫后總豐度降低了22.66%。但以上真菌豐度隨溫度變化的差異都不顯著?？傮w來說，不論是在自然土壤中，還是農田土壤中，真菌群落總豐度都沒有隨溫度升高發(fā)生顯著性變化。

圖1 土壤性質對真菌群落總豐度溫度敏感性的影響

2.2 土壤性質對溫度敏感真菌目個數的影響

從圖2結果可看出，在土壤性質由自然土壤改變?yōu)檗r田土壤后，來自自然土壤的真菌中溫度敏感真菌目個數由11減少為10，其中冷響應真菌目的數目不變，熱響應真菌目的個數由2減少為1。另外，在土壤性質由農田土壤改變?yōu)樽匀煌寥篮螅瑏碜赞r田土壤的真菌中溫度敏感真菌目個數由7增加到11，其中熱響應真菌目的數目不變，冷響應真菌目的個數由5增加到9。

圖2 土壤性質對溫度敏感真菌目個數的影響

2.3 土壤性質對溫度敏感真菌累積相對豐度的影響

從圖3結果可看出，在培養(yǎng)溫度從15℃升高到25℃后，自然土壤的真菌在自然土壤中冷響應和熱響應真菌累積相對豐度之和從2.22%減少為1.35%，其中熱響應真菌累積相對豐度從0.09%增加到0.48%，冷響應真菌累積相對豐度從2.12%減少為0.88%。土壤性質改為農田土壤后，自然土壤的真菌中冷響應和熱響應真菌累積相對豐度之和從1.25%減少為0.56%，其中熱響應真菌累積相對豐度從0.001%增加到0.03%，冷響應真菌累積相對豐度從1.25%減少為0.53%。在培養(yǎng)溫度從15℃升高到25℃后，農田土壤的真菌在農田土壤中冷響應和熱響應真菌累積相對豐度之和從13.66%增加到19.03%，其中熱響應真菌累積相對豐度從13.54%增加到18.99%，冷響應真菌累積相對豐度從0.12%減少為0.04%。土壤性質改為自然土壤后，農田土壤的真菌中冷響應和熱響應真菌累積相對豐度之和從6.01%減少為2.51%，其中熱響應真菌累積相對豐度從0.01%增加到0.11%，冷響應真菌累積相對豐度從6.00%減少為2.40%。

圖3 土壤性質對溫度敏感真菌累積相對豐度的影響

2.4 土壤性質對冷、熱響應真菌群落組成的影響

圖4表示的是冷、熱響應真菌群落內部相對豐度組成。15℃下，在自然土壤環(huán)境下，來自自然土壤的真菌中熱響應真菌有Capnodiales、Chaetothyriales，內部群落豐度組成分別為1.06%、98.94%；土壤環(huán)境改為農田土壤后，熱響應真菌有Eurotiales，內部群落豐度組成為100%。另外，來自農田土壤的真菌在農田土壤環(huán)境下熱響應真菌有Capnodiales、Sordariales，內部群落豐度組成分別為99.96%、0.04%；土壤環(huán)境改為自然土壤后，熱響應真菌有Chaetothyriales、Hypocreales，內部群落豐度組成分別為91.67%、8.33%。25℃下，改變土壤性質對熱響應真菌相對豐度的影響類似于15℃。

圖4 土壤性質對熱、冷響應真菌群落組成的影響

從圖4結果可看出，15℃下，在自然土壤環(huán)境下，來自自然土壤的真菌中冷響應真菌有Agaricales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Hypocreales、Mortierellales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Tremellales，內部群落豐度組成分別為0.44%、37.79%、4.09%、6.26%、3.95%、1.68%、6.07%、34.73%、4.98%；土壤環(huán)境改為農田土壤后，冷響應真菌有Agaricales、Capnodiales、Chaetothyriales、Corticiales、Eurotiales、Hypocreales、Pleosporales、Sordariales、Spizellomycetales，內部群落豐度組成分別為6.96%、54.58%、3.61%、0.50%、0.59%、30.02%、0.34%、1.43%、2.01%。另外，來自農田土壤的真菌在農田土壤環(huán)境下冷響應真菌有Chaetothyriales、Eurotiales、Helotiales、Microascales、Pezizales，內部群落豐度組成分別為58.97%、12.82%、8.55%、8.55%、11.11% ；土壤環(huán)境改為自然土壤后，冷響應真菌有Botryosphaeriales、Capnodiales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Trechisporales、Verrucariales，內部群落豐度組成分別為2.24%、60.60%、5.83%、0.44%、3.20%、8.82%、9.29%、6.76%、2.83%。25℃下，改變土壤性質對冷響應真菌相對豐度的影響類似于15℃。

2.5 土壤性質對土壤真菌的溫度響應程度的影響

如圖5所示，把土壤中所有真菌在目水平下分類后再比較相對豐度變化，以log10(相對豐度變化率%)來表征。在自然土壤環(huán)境下，來自自然土壤的真菌中因升溫相對豐度有顯著性減少的菌目有Eurotiales、Hypocreales、Sordariales，分別減少1.02、1.66、1.33；土壤環(huán)境改為農田土壤后，因升溫相對豐度有顯著性減少的菌目有Capnodiales、Pezizomycotina_In_se，分別減少1.50、1.78。來自農田土壤的真菌在農田土壤環(huán)境下因升溫相對豐度有顯著性減少的菌目有Chaetosphaeriales、Pezizales、Pyrenulales，分別減少1.49、1.45、1.80；相對豐度有顯著性增加的菌目有Capnodiales，增加1.51；土壤環(huán)境改為自然土壤后，因升溫相對豐度有顯著性減少的菌目有Capnodiales、Chaetosphaeriales、Pezizomycotina_In_se，分別減少1.55、1.90、1.41；相對豐度有顯著性增加的菌目有Pleosporales，增加1.24。

圖5 土壤性質對土壤真菌的溫度響應程度的影響[目水平下，log10(相對豐度變化率%)]

3 結論與討論

本文探討了改變土壤性質對土壤真菌溫度敏感性的影響。本試驗研究結果表明，雖然農田土壤真菌總豐度受土壤性質的影響大于自然土壤真菌，但改變土壤性質對自然和農田土壤真菌總豐度溫度敏感性均沒有產生顯著性的影響，因此，本研究進一步要從群落結構的角度進行深入的分析。

有研究表明，在對具有溫度敏感真菌分類時，在目水平上的分類最為靈敏，因此本試驗也采用目水平上的分類[10]。本研究鑒定了對于溫度具有敏感性的真菌，并依據其相對豐度變化與溫度變化的正負關系將其分為熱響應真菌和冷響應真菌。結果表明，無論是自然土壤或農田土壤的真菌，一旦改變其所在的土壤性質就會改變溫度敏感真菌的個數。改變土壤性質主要減少自然土壤真菌中的熱響應真菌的個數，增加農田土壤真菌中的冷響應真菌的個數。有研究表明，升溫會增加土壤真菌的多樣性，但是施肥處理則會降低真菌的多樣性，這就可能導致自然土壤真菌在改變土壤性質為農田土壤后溫度敏感真菌個數的減少，而農田土壤真菌在改變土壤性質為自然土壤后溫度敏感真菌個數增加[11]。改變土壤性質分別減少了自然土壤真菌中熱響應和冷響應真菌的累積相對豐度，增加了農田土壤中冷響應真菌的累積相對豐度，而熱響應真菌的累積相對豐度降低。

以往研究表明，溫度的升高會導致真菌整體群落組成的改變[12-14]。本研究進一步證實，改變土壤性質使這些溫度敏感真菌的群落組成發(fā)生了改變。土壤性質改變后，自然土壤真菌的熱響應真菌由Capnodiales、Chaetothyriales變?yōu)镋urotiales；冷響應真菌由Agaricales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Hypocreales、Mortierellales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Tremellales變?yōu)锳garicales、Capnodiales、Chaetothyriales、Corticiales、Eurotiales、Hypocreales、Pleosporales、Sordariales、Spizellomycetales。改變土壤性質后，農田土壤真菌的熱響應真菌由Capnodiales、Sordariales變?yōu)镃haetothyriales、Hypocreales；冷響應真菌由Chaetothyriales、Eurotiales、Helotiales、Microascales、Pezizales變?yōu)锽otryosphaeriales、Capnodiales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Trechisporales、Verrucariales。然而，與其他研究者的結果對比來看，本試驗中溫度敏感真菌占真菌總體的比例還是小了許多[15]，原因可能是其他研究者的培養(yǎng)時間長于本試驗的培養(yǎng)時間。如果延長培養(yǎng)時間，土壤真菌種群還會改變，因為真菌群落對升溫具有一定的抗性，因此需要更長的時間才能體現(xiàn)出溫度所帶來的影響，從而更好地研究土壤性質改變對真菌溫度敏感性的影響[16]。

不同微生物往往因為遺傳背景不同，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的功能也具有較大差異[17]。有研究表明，在本研究中發(fā)現(xiàn)的受土壤性質影響的溫度敏感真菌的功能可能存在差異。如Capnodiales是一種拮抗菌，可以增強植物的抗病性[18]；Chaetothyriales與磷代謝相關[19]；Eurotiales、Chaetosphaeriales、Corticiales都是降解纖維素的真菌[20-22]；Mortierellales是一種腐生菌，善于降解有機質[23]；Pezizales是菌根共生菌，會促進植物生長[24]；Spizellomycetales在土壤氮循環(huán)方面發(fā)揮作用[25]。因此，根據改變土壤性質造成的自然土壤溫度敏感真菌群落的變化，推測熱響應真菌功能由植物保護、磷代謝功能變?yōu)槔w維素降解功能；冷響應真菌功能由有機質降解、促進植物生長功能變?yōu)橹参锉Ｗo、磷代謝、氮代謝功能。此外，Sordariales具有反硝化功能[26]；Hypocreales與磷循環(huán)相關[27]；Helotiales與氮循環(huán)相關[28]；Botryosphaeriales是一種內生菌，也是植物的病原菌[29]。因此，根據改變土壤性質造成的農田土壤溫度敏感真菌群落的變化，推測熱響應真菌功能由植物保護、反硝化功能變?yōu)榱状x功能；冷響應真菌功能由磷代謝、氮代謝功能變?yōu)橹参锊『Α⒗w維素降解、反硝化功能。

本實驗探索了改變紅壤性質對真菌溫度敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)：(1)改變土壤性質會改變溫度敏感真菌目分類水平上的數量；(2)改變土壤性質會改變溫度敏感真菌的種類和相對豐度。雖然本研究沒有研究真菌所對應的功能，但根據以往關于微生物功能具有遺傳特異性的研究結果[17]，可以推測，改變土壤性質可能對真菌功能的溫度敏感性產生深遠影響。

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