胡夢，程玉冰，張培燕，劉英，胡海峰*

(1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040；2.國藥集團健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203)

百藥煎是我國傳統(tǒng)中藥飲片的一種，由五倍子、茶葉和酒曲等原料經(jīng)自然發(fā)酵而成，臨床上多用于消化系統(tǒng)疾病的治療或調(diào)理。沒食子酸為百藥煎的主要藥效物質(zhì)，由五倍子中的可水解鞣質(zhì)經(jīng)產(chǎn)單寧酶微生物轉(zhuǎn)化而來[1]，其具有抗腫瘤、殺錐蟲、抗炎、抑菌、抗病毒、降糖和降酯等活性[2]，其中百藥煎的傳統(tǒng)炮制是在自然狀態(tài)下由原料中所含微生物混合發(fā)酵而成，參與發(fā)酵的菌種和數(shù)量波動性較大，且易受致病菌及有害菌的污染，生產(chǎn)條件不易控制，產(chǎn)品質(zhì)量隨環(huán)境變化波動較大，發(fā)酵終點憑主觀經(jīng)驗判斷，因人而異，從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性，不利于百藥煎工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[3]。為克服百藥煎傳統(tǒng)炮制的不足，本研究在前期分離并初步鑒定了百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中微生物的基礎(chǔ)上，剔除致病菌后以藥效物質(zhì)沒食子酸的含量變化為篩選指標(biāo)，分別考察單菌及混菌發(fā)酵組合對百藥煎中鞣質(zhì)轉(zhuǎn)化生成沒食子酸的能力，期望篩選得到協(xié)同降解鞣質(zhì)生成沒食子酸的最佳混菌組合。

1 儀器與材料

1.1 樣品信息

百藥煎傳統(tǒng)炮制品由四川輔正藥業(yè)提供，鑒定人：河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授。五倍子(安徽亳州滬譙中藥飲片公司，批號：20160824)；綠茶(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉專業(yè)市場)；酒槽(鎮(zhèn)江酒廠)；沒食子酸對照品(上海勃生物工程有限公司，純度99%以上)。樣品編號C1～C8分別是在發(fā)酵時間0、6、18、24、30、42、48、66 h取樣，樣品經(jīng)60 ℃烘干3 h，打粉過40目篩。

1.2 菌種及細胞

百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中所分離得到的菌種，紙片法初篩得到的細菌HMB1、HMB2、HMB3、HMB5、HMB6；酵母菌HMY1、HMY2、HMY5、HMY6、HMY7；絲狀真菌HMF1、HMF2、HMF3均具有降解鞣質(zhì)能力，詳情見文獻[4]。金黃色葡萄球菌本實驗室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。1#液體培養(yǎng)基：2% C2粉末(m·v-1)，pH自然，裝液量30 mL，121 ℃滅菌30 min；2#固體培養(yǎng)基：25% C2粉末(m·v-1)，pH自然，2.5 g添加，121 ℃滅菌30 min；3#固體培養(yǎng)基：50%C2粉未(m·v-1)，PH自然，裝量5 g，121 ℃滅菌30 min。。

1.4 儀器

電子天平(上海精科天平)；精密數(shù)顯示酸度計(Sartorius)；壓力蒸汽滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；高效液相儀(Waters1525二元泵+2707自動進樣器+2998DAD檢測器)；離心機Avanti J-26 XP(BECK MAN CONLTER)。

2 方法

2.1 種子液制備

細菌用LB液體，酵母菌、絲狀真菌用PDA液體，在30 ℃下培養(yǎng)，150 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h后，調(diào)整細菌、酵母菌活菌數(shù)為1×106CFU·mL-1，絲狀真菌菌體量達3 mg·mL-1。

2.2 搖瓶發(fā)酵篩選

液體搖瓶培養(yǎng)篩選降解1#培養(yǎng)基中鞣質(zhì)生成沒食子酸能力較好的菌株及其與同類菌株和非同類菌株間協(xié)同作用較優(yōu)的混菌組合。發(fā)酵搖瓶接種總量為2 mL，各菌接種比例相同，在30 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)6 d，HPLC測定發(fā)酵液中沒食子酸的量，以1#培養(yǎng)基為空白對照。

2.3 搖瓶篩選獲得最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵驗證

采用2#培養(yǎng)基進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng),驗證篩選菌株間協(xié)同降解鞣質(zhì)生成沒食子酸的作用，每瓶接種總量為2 mL,不同菌株間接種比例相同,30 ℃條件下培養(yǎng)66 h測定發(fā)酵液中沒食子酸含量。

2.4 最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵時間曲線測定

最佳混菌組合的菌株接種于3#培養(yǎng)基中，細菌接種量各為0.2 mL、酵母菌接種量各為0.4 mL，分別于發(fā)酵0、18、30、42、48、66、72 h取樣測定發(fā)酵液中沒食子酸和鞣質(zhì)的含量。

2.5 指標(biāo)檢測

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用甲醇配制沒食子酸，質(zhì)量濃度為1.03 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試液1的制備：分別精密稱取百藥煎炮制樣品(C1～C8)粉末各0.5 g，加水30 mL，稱重后浸提2 h，超聲提取2次，每次30 min，補足重量過濾。取濾液1 mL過0.45 μm濾膜后測定沒食子酸含量。

供試液2的制備：取20 mL供試液1，添加10 mL 12 mol·L-1濃鹽酸，振蕩混合均勻后，沸水浴30 min，取水解液1 mL于潔凈試管中，滴加明膠液1～2滴，若無白色沉淀出現(xiàn)，則表明鞣質(zhì)水解完全，取濾液1 mL過0.45 μm濾膜過濾后測定沒食子酸含量。

可水解鞣質(zhì)含量=水解后沒食子酸的含量-水解前沒食子酸含量[5]

(1)

沒食子酸HPLC檢測的色譜條件[6]：色譜柱Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(15∶85)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為273 nm；柱溫為30 ℃；進樣量20 μL。

2.6 樣品抑菌活性測定

供試液3制備：取百藥煎終樣品粉末0.5 g，加水10 mL，超聲提取30 min，過濾得百藥煎提取液。

抑菌活性檢測：LB制備金黃色葡萄球菌的菌濃約為1×106CFU菌懸液，取0.5 mL菌懸液，加至25 mL LB培養(yǎng)基振蕩混勻倒平板。滴加20 μL樣品提取液于直徑為3 mm的圓形紙片上，后于37 ℃培養(yǎng)2 d，測量紙片周圍抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中沒食子酸及鞣質(zhì)含量變化

百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中沒食子酸和鞣質(zhì)含量變化見圖1。

圖1 百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中沒食子酸和鞣質(zhì)的含量變化

由圖1可知，隨百藥煎傳統(tǒng)炮制時間的增加，樣品中鞣質(zhì)含量逐步減少，沒食子酸含量逐步增加，表明百藥煎中微生物逐步將鞣質(zhì)轉(zhuǎn)化成沒食子酸。

3.2 鞣質(zhì)降解菌株的篩選

通過摸索性實驗發(fā)現(xiàn)，菌株液體搖瓶篩選過程中，隨著培養(yǎng)時間的增加其代謝轉(zhuǎn)化鞣質(zhì)生長沒食子酸量增多，造成培養(yǎng)基pH逐步降低，對菌株生長代謝影響較大，實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為2 mL時，能明顯縮短發(fā)酵周期至6 d。

3.2.1 單菌搖瓶篩選 分別單獨于1#液體培養(yǎng)基中接種各菌種子液各2 mL，在30 ℃、150 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)6 d，后測定發(fā)酵液中沒食子酸的量，1#液體培養(yǎng)基為空白對照，結(jié)果見圖2 。

由圖2可知，單菌搖瓶培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，細菌HMB5、酵母菌HMY2分別是同類菌株中具轉(zhuǎn)化百藥煎中鞣質(zhì)生成沒食子酸能力最強的菌株，而各絲狀真菌間能力對比差別不大。

圖2 單菌搖瓶培養(yǎng)篩選結(jié)果

3.2.2 同類菌株混合培養(yǎng) 分別將同類菌株中轉(zhuǎn)化百藥煎中鞣質(zhì)生成沒食子酸能力最強單菌與其他同類菌株兩兩組合發(fā)酵培養(yǎng)，接種量各為1 mL，在30 ℃、150 r·min-1，發(fā)酵培養(yǎng)6 d后測定沒食子酸的量，以1#培養(yǎng)基和單菌發(fā)酵培養(yǎng)為對照，結(jié)果見圖3。

圖3 同類菌株混合搖瓶培養(yǎng)篩選

由圖3可知，搖瓶篩選發(fā)現(xiàn)細菌HMB2和HMB5，酵母菌HMY1和HMY2，絲狀真菌HMF2和HMF3的各組合中菌株具有相互協(xié)同增強降解百藥煎中鞣質(zhì)生成沒食子酸的作用。

3.2.3 非同類菌株間混合培養(yǎng)

3.2.3.1 細菌、酵母菌混合培養(yǎng) 將細菌組合HMB5、HMB2與酵母菌組合HMY1、HMY2間分別進行三菌和四菌組合，接種于1#液體培養(yǎng)基中，每瓶接種總量為2 mL，各菌接種量比例相同，在30 ℃、150 r·min-1，培養(yǎng)6 d后檢測發(fā)酵液中沒食子酸的量，以同類菌株混合發(fā)酵為對照，結(jié)果見圖4。

圖4 細菌酵母菌混合培養(yǎng)結(jié)果

由圖4可知，菌株HMB2、HMB5、HMY1、HMY2間具有協(xié)同增強轉(zhuǎn)化百藥煎鞣質(zhì)成沒食子酸的作用。

3.2.3.2 細菌、酵母菌、絲狀真菌混合培養(yǎng) 分別將混菌HMB2、HMB5、HMY1、HMY2與最優(yōu)絲狀真菌組合HMF2、HMF3間進行組合，接種于1#培養(yǎng)基中，每瓶接種總量為2 mL，各菌接種量比例相同，在30 ℃、150 r·min-1，發(fā)酵培養(yǎng)6 d后檢測發(fā)酵液中沒食子酸的量，結(jié)果見圖5。

圖5 最優(yōu)細菌酵母菌組合與絲狀真菌混合搖瓶培養(yǎng)

由圖5可知，絲狀真菌HMF2、HMF3與最優(yōu)細菌酵母菌組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2間具有拮抗轉(zhuǎn)化百藥煎鞣質(zhì)生成沒食子酸作用。因此搖瓶發(fā)酵篩選得到的組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2為轉(zhuǎn)化百藥煎鞣質(zhì)生成沒食子酸的最佳混菌組合。

3.3 搖瓶篩選獲得最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵驗證

分別將最強單菌HMB5和HMY2、最佳細菌混菌組合(HMB1與HMB5)、最佳酵母菌混菌組合(HMY1與HMY2)、最佳混菌組合(HMB5、HMB1、HMY1和HMY2)接種于2#固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種總量為2 mL，各菌株接種比例相同，在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)66 h，結(jié)束后檢測發(fā)酵物中沒食子酸的含量，結(jié)果見圖6。

圖6 最優(yōu)混菌組合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

由圖6可知，最佳混菌HMB2、HMB5、HMY1、HMY2組合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)協(xié)同轉(zhuǎn)化百藥煎中鞣質(zhì)生成沒食子酸的能力優(yōu)于最強單菌及最優(yōu)同類混菌組合。

3.4 最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵時間曲線

初步研究了最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵相關(guān)條件，包括接種量、菌株接種比例和底物濃度的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株接種于3#培養(yǎng)基，細菌接種量各為0.2 mL、酵母菌接種量各為0.4 mL時發(fā)酵效果最好，因此在該發(fā)酵條件下分別于發(fā)酵0、18、30、42、48、66、72 h取樣測定發(fā)酵液中沒食子酸和鞣質(zhì)隨時間的變化情況，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，百藥煎最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的增加鞣質(zhì)含量呈遞減趨勢，沒食子酸的含量呈先增加后減少趨勢，培養(yǎng)至66 h樣品中沒食子酸含量最大為0.589 g·g-1樣品，優(yōu)于百藥煎傳統(tǒng)炮制品中沒食子酸含量(0.52 g·g-1樣品)。

圖7 最優(yōu)混菌組合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程中沒食子酸和鞣質(zhì)含量變化

3.5 百藥煎傳統(tǒng)炮制品和百藥煎最佳混菌發(fā)酵樣品抑菌活性測定

比較測定百藥煎傳統(tǒng)炮制品和百藥煎的最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)至66 h，各樣品對金黃色葡萄球菌的抑制活性，結(jié)果見圖8。

圖8 百藥煎炮制品和發(fā)酵樣品抑菌活性測定

由圖8可知，百藥煎最佳混菌固態(tài)發(fā)酵66 h所得樣品對金黃色葡萄球菌抑制活性優(yōu)于百藥煎傳統(tǒng)炮制品。

4 討論

百藥煎傳統(tǒng)炮制飲片是在自然狀態(tài)下混菌發(fā)酵制成，隨著炮制時間的增加樣品中鞣質(zhì)含量呈遞減趨勢，沒食子酸的含量則呈遞增趨勢，該結(jié)果表明，百藥煎中所含微生物逐步將鞣質(zhì)轉(zhuǎn)化成沒食子酸。因此本實驗以百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中分離純化獲得具降解鞣質(zhì)能力的微生物作為篩選出發(fā)菌種庫，分別進行單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵，以HPLC方法檢測發(fā)酵液中沒食子酸或鞣質(zhì)的含量，搖瓶篩選得到具協(xié)同降解鞣質(zhì)生成沒食子酸的能力的最佳混菌組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2。最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵后樣品中沒食子酸的量約為0.59 g·g-1百藥煎，而百藥煎傳統(tǒng)炮制品中沒食子酸為0.52 g·g-1百藥煎，增加了約11%，且最佳混菌固態(tài)發(fā)酵后樣品對金黃色葡萄球菌的抑制活性優(yōu)于百藥煎傳統(tǒng)炮制品。

本研究篩選得到最佳混菌組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2不僅為實現(xiàn)百藥煎的現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)提供了可發(fā)酵調(diào)控菌種基礎(chǔ)，同時也為分離并利用傳統(tǒng)發(fā)酵中藥的微生物提供了一定的參考。

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