曲繼旭，賀雨馨，孫志蓉*，蘇娟，廖曉康，楊繼勇

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.貴州省赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，貴州 赤水 564700)

石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科第二大屬，包括約1000種植物，截止目前我國記載的石斛共74種2變種，產(chǎn)于秦嶺以南諸省區(qū)，尤其云南南部為多[1]。其中，金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindl.和鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo.已列入2015年版《中華人民共和國藥典》[2]，紫皮石斛DendrobiumdevonianumPaxt.因野生及栽培產(chǎn)量較大，質量類似鐵皮石斛，具有很大的開發(fā)空間[3]。中藥石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并列為上品，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱等病癥，現(xiàn)代藥理學研究表明石斛還具有抗衰老、增強免疫力等作用[4]，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。近年來，石斛花被人們開發(fā)成保健品，以花茶形式飲用，研究者們已對部分石斛花的揮發(fā)性成分進行了研究[5-6]，但有關石斛花營養(yǎng)價值及紫皮石斛花揮發(fā)性成分未見報道。本實驗以金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮4種石斛花為材料，采用氨基酸自動分析法和氣質聯(lián)用色譜技術對其營養(yǎng)價值及揮發(fā)性成分進行分析比較，以期為石斛花的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 材料

實驗所用石斛花樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學孫志蓉教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛DendrobiumnobileLindl.(貴州赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司提供)、鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindl.(云南德潤康股份有限公司提供)、鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo.(浙江杭州小香生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供)、紫皮石斛DendrobiumdevonianumPaxt(湖北林科院提供)的干燥花。

1.2 儀器

日立L-8900型氨基酸自動分析儀；美國Agilent 7890A/5975C氣質聯(lián)用儀，萃取針材質：ACAR/PDMS/DVB；METTLER-AE240型1/100000電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

2 方法

2.1 氨基酸測定方法

稱取一定質量的樣品(含50 mg蛋白)于20 mL的水解管中，加入16 mL 6mol·L-1的鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，在110 ℃下水解22～24 h取出，取出冷卻開管，用去離子水無損轉移到50 mL容量瓶中，并定容。準確量取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干備用。采用日立L-8900氨基酸分析儀(2622#PH離子交換色譜柱，60 mm×4.5 μm；柱溫為57 ℃；柱后衍生，衍生反應溫度為135 ℃；進樣量為20 μL；流速：衍生試劑為0.35 mL·min-1，緩沖液為0.4 mL·min-1)進行氨基酸含量檢測，上機前準確加入1 mL 0.02 mol·L-1的鹽酸溶液充分溶解，后用0.22 μm的水相濾膜過濾后，進行上機分析。由于采用酸水解法處理樣品，因此本實驗不考慮色氨酸的檢測。

2.2 營養(yǎng)價值評價方法

參照Bano方法計算氨基酸評分值(Amino Acid Score，AAS)[7]，參照FAO推薦的方法測定化學評分(Chemical Score，CS)[8]，參照朱圣陶等[9]研究方法計算氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC)。

AAS=待測蛋白中某種必需氨基酸含量(mg·g-1)/FAO評分模式某種氨基酸含量(mg·g-1)

(1)

CS=待測蛋白中某種必需氨基酸含量(mg·g-1)/雞蛋評分模式中該種氨基酸含量(mg·g-1)

(2)

RAA=待測蛋白質氨基酸含量/FAO評分模式氨基酸含量

(3)

RC=氨基酸比值/氨基酸比值之均數(shù)

(4)

SRC=100-CV×100

(5)

式中：CV是RC的變異系數(shù)，CV=標準差/均數(shù)。

2.3 揮發(fā)性成分測定方法

2.3.1 GC條件 色譜柱為DB-5MS毛細管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1 mL·min-1，分流，分流比為5∶1；進樣溫度為250 ℃，柱箱溫度為40 ℃；按程序升溫(起始溫度為40 ℃，保持2 min；以5 ℃·min-1升至160 ℃，保持0 min；以8 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min：總用時50.25 min)。

2.3.2 MS條件 EI電離源，能量為70 eV，倍增電壓為1800 V；離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描范圍為m/z40～400，間隔0.3 s。

2.3.3 樣品測定 樣品研碎加入20 mL頂空瓶中，至瓶身一半位置，蓋緊瓶蓋。插入ACAR/PDMS/ DVB萃取頭，于70 ℃下萃取50 min后，將萃取頭插入氣質聯(lián)用儀進樣口，在250 ℃進樣口解吸5 min，進行分析。采集到的質譜圖利用計算機譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量，檢索譜圖庫為NIST 08。

3 結果與分析

3.1 4種石斛花蛋白的氨基酸組分比較

由表1可知，4種石斛花均含17種氨基酸(色氨酸未測)，其中均包括人體所必需氨基酸7種，但氨基酸含量存在差異，其氨基酸總量(TAA)排序為紫皮>鼓槌>鐵皮>金釵。植物必需氨基酸的種類、含量及組成比例是評價氨基酸營養(yǎng)價值優(yōu)劣的重要指標，根據(jù)FAO/WHO建議的理想蛋白條件：必需氨基酸/總氨基酸的值(EAA/TAA)應在40%左右，必需氨基酸/非必需氨基酸的值(EAA/NEAA)應在60%以上。數(shù)據(jù)表明4種石斛花EAA/TAA值排序分別為金釵>紫皮>鐵皮>鼓槌，除鼓槌石斛花外，其余石斛花均在40%左右。而EAA/NEAA值排序為金釵>紫皮>鐵皮>鼓槌，EAA/TAA值同樣是除鼓槌石斛花外，其余石斛花均大于60%。該結果表明金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花符合優(yōu)質蛋白質的標準。金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花EAA含量最高的均為亮氨酸，而鼓槌石斛花則以蘇氨酸最高；所含的蛋氨酸均最低。金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花NEAA含量最高的均為谷氨酸，而鼓槌石斛花則以天冬門氨酸最高；所含的胱氨酸含量均最低。

表1 4種石斛花蛋白的氨基酸組成

注：*為必需氨基酸；**為半必需氨基酸。

3.2 4種石斛花蛋白的營養(yǎng)價值評價

植物蛋白質的營養(yǎng)價值與蛋白質含量、氨基酸種類含量和EAA所占比例等相關，目前國際上均以FAO/WHO推薦的必需氨基酸模式和標準雞蛋蛋白的必需氨基酸模式作參比，下面采用4種非生物學指標對4種石斛花蛋白進行營養(yǎng)價值的評價，可以更好地闡述不同石斛花蛋白的營養(yǎng)價值。

3.2.1 氨基酸評分(AAS)和化學評分(CS) 4種石斛花的AAS和CS見表2。AAS值表示被測蛋白與FAO標準蛋白的接近程度，CS值表示待測蛋白與標準雞蛋蛋白的接近程度，AAS值和CS值越接近1，說明待測蛋白與模式蛋白越接近，氨基酸營養(yǎng)價值越高。由表2可知，金釵、鐵皮、紫皮3種石斛花的AAS總評分和CS總評分更接近于1，但數(shù)值相近，說明這3種石斛花的必需氨基酸模式均能夠滿足人體需求，營養(yǎng)價值均較高。當以FAO模式的AAS為參考標準時，AAS最小的氨基酸為第一限制氨基酸，由表2可知，4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)；當以全雞蛋蛋白模式的CS為參考標準時，CS最小的氨基酸為第一限制氨基酸，由表2可知，4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸；綜合表明4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸。

3.2.2 氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC) RC是根據(jù)氨基酸平衡理論，利用WHO/FAO的氨基酸模式進行蛋白質質量評價。RC表示與模式氨基酸相當量的待測蛋白氨基酸的比值，若待測蛋白氨基酸組成與氨基酸模式一致，則RC都應等于1，RC>1表示該氨基酸相對過剩，RC<1表示該氨基酸相對不足，RC最小的氨基酸為第一限制氨基酸。由表3可知，4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸?，F(xiàn)代研究認為氨基酸不足影響蛋白質的營養(yǎng)價值，氨基酸過剩也會限制氨基酸的營養(yǎng)價值，SRC是采用各種必需氨基酸偏離氨基酸模式的離散度來評價蛋白質的質量，當待測蛋白的RC越分散，表明這些氨基酸在氨基酸平衡上的負貢獻越大，SRC變小，蛋白質的營養(yǎng)價值越差。由表3看出，SRC(金釵)>SRC(紫皮)>SRC(鐵皮)>SRC(鼓槌)，結果表明金釵石斛花營養(yǎng)價值最高，紫皮、鐵皮石斛花次之，而鼓槌石斛花最低。

表2 4種石斛花蛋白的氨基酸評分(AAS)和化學評分(CS)

注：*表示所對應的氨基酸為第一限制氨基酸；—表示未檢出。

表3 4種石斛花氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC)

注：*表示所對應的氨基酸為第一限制氨基酸。

3.3 4種石斛花蛋白的揮發(fā)性成分分析

依據(jù)GC-MS條件對4種石斛花的揮發(fā)性成分進行分析，分析鑒定結果見表4。結果表明，從金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮4種石斛花的揮發(fā)性成分分別鑒定出37、31、26、21種化合物，質量分數(shù)分別為63.17%、61.74%、73.72%和53.44%，主要為醛類、烷烴類、酯類、醇類和含氮化合物。其中，金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮石斛花共有的揮發(fā)性成分有3種，分別為2，6-二叔丁基對甲酚(鼓槌2.30%，紫皮1.62%，鐵皮0.76%，金釵0.67%)、十四烷(金釵1.23%，鐵皮0.67%，鼓槌0.50%，紫皮0.25%)和十六烷(紫皮3.05%，鐵皮0.92%，金釵0.84%，鼓槌0.48%)。金釵石斛花中乙醇含量最高，質量分數(shù)達16.06%；其他揮發(fā)性成分質量分數(shù)大于2%的化合物有7種，分別是正己烷(5.97%)、順-2，3-二甲基-環(huán)丁酮(4.22%)、1，1′-(2-甲基-1-亞丙烯基)雙-苯(3.71%)、十二烷(3.27%)、十三烷(3.09%)、甲氧基乙酸丁酯(2.51%)和柏木腦(2.49%)。鼓槌石斛花中乙醛含量最高，質量分數(shù)達27.25%；其他揮發(fā)性成分質量分數(shù)大于2%的化合物有5種，分別是偶氮甲烷(11.16%)、甲基醚(3.73%)、頭孢噻肟(3.59%)、2，6-二叔丁基對甲酚(2.30%)和丁氧硫氰醚(2.25%)。鐵皮石斛花中揮發(fā)性成分以乙醛(26.64%)為主；其余質量分數(shù)大于2%的成分有5種，分別為正丁基異氰酸乙酸酯(10.99%)、偶氮甲烷(10.04%)、頭孢噻肟(5.35%)、壬醛(4.19%)和丁氧硫氰醚(3.98%)。紫皮石斛花揮發(fā)性成分中含量較高的成分為頭孢噻肟(16.76%)、乙醛(13.90%)和偶氮甲烷(12.07%)，其余質量分數(shù)大于2%的揮發(fā)性成分為十六烷(3.05%)。

表4 4種石斛花揮發(fā)油GC-MS分析結果

表4(續(xù))

表4(續(xù))

注：—表示未檢出。

4 結論與討論

氨基酸是有機體組織細胞的基本組成成分，也是生命體合成蛋白質的基本原料，且部分氨基酸在生物體內(nèi)還具有一定的生物活性功能[10]。亮氨酸是人體必需氨基酸，除了可參與機體蛋白質、糖脂代謝的調(diào)控，還影響機體多種激素的分泌，同時還可作為信號分子參與多種生理功能的維持與調(diào)控[11]；賴氨酸也是必需氨基酸，可參與人體的新陳代謝等生理活動，且當食物中賴氨酸的含量不足時，會限制其他氨基酸的利用[12]。本實驗采用氨基酸自動分析儀測定金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮4種石斛花的氨基酸組分，并采用相關的非生物學指標對其氨基酸進行營養(yǎng)評價；結果表明，4種石斛花均包含人體所必需的氨基酸7種，金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花EAA/TAA值與EAA/NEAA值均符合理想蛋白的標準，而鼓槌石斛花則低于標準。通過AAS和CS評價法可知，金釵、紫皮和鐵皮石斛花均符合FAO/WHO模式蛋白，營養(yǎng)價值較高，但三者數(shù)值接近，營養(yǎng)價值差異性不高，通過RC和SRC評價法可知，SRC(金釵)>SRC(紫皮)>SRC(鐵皮)>SRC(鼓槌)，金釵石斛花營養(yǎng)價值最高，紫皮與鐵皮石斛花次之，鼓槌石斛花最低。通過分析可知，金釵、鐵皮和紫皮石斛花必需氨基酸中亮氨酸含量均最高，鼓槌石斛花中蘇氨酸最高，而蛋氨酸和胱氨酸均為4種石斛花的第一限制氨基酸。故作為食物或飲品用之，可考慮石斛花與其他食物的相互補充。

植物花香主要是由萜烯類、苯型烴類、脂肪酸及其衍生物以及一些含硫、含氮的化合物組成[13]。本研究通過GC-MS分別從紫皮、鼓槌、鐵皮和金釵石斛花的揮發(fā)性成分中分析鑒定出37、31、26、21種化合物，4種石斛花的揮發(fā)性成分僅有3種共有化合物，且質量分數(shù)也存在較大差異。其中，金釵石斛花與其他3種花相比，揮發(fā)性成分差異較明顯。鐵皮石斛花所含醛類、酯類、含氮類居多，此結果與文獻[5]報道的結果差異不大，而與文獻[6]的結果差異明顯，結果的差異在極大程度上是因為鐵皮石斛花的產(chǎn)地所造成的。鼓槌和紫皮石斛花所含的醛類、含氮類成分也較高，而金釵石斛所含的醇類、烷烴類和芳香烴類成分居多。石斛花中所含的部分揮發(fā)性成分不僅具有獨特的清香氣味，而且具有廣泛的藥理活性。鐵皮石斛花中所含的壬醛含量較高，有強的油脂氣味，具有玫瑰、柑橘等植物的香氣，可用于調(diào)制香料或食品調(diào)料；金釵石斛中的柏木腦具有香氣，可用作香料以及化妝品定香劑[14]；紫皮石斛花含量較高的頭孢噻肟對致病菌生長有著較好的抑制作用[15]。

綜上所述，綜合評價紫皮、鼓槌、鐵皮和金釵4種石斛花的氨基酸營養(yǎng)價值，金釵石斛花的營養(yǎng)價值最好，鐵皮和紫皮石斛花次之，鼓槌石斛花最低；4種石斛花所含的揮發(fā)性成分種類豐富，還具有香氣和廣泛的藥理活性，研究為石斛花的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

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