方曉暉 - 但德苗 - 錢(qián)時(shí)權(quán) - 陸兆新 -

(1. 蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

紅皮火龍果(Dragon fruit)，又稱紅龍果、龍珠果等，屬仙人掌科植物，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種活性物質(zhì)，如甜菜苷、色素、植物多糖和酚醛樹(shù)脂等[1]，其中，植物多糖具有抑菌[2]、抗氧化[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]和預(yù)防癌癥[5]等生物活性。目前，有關(guān)紅皮火龍果的研究主要集中在果皮色素和果膠的提取等方面[6]。

紅皮火龍果皮含有大量色素，不利于植物多糖的分離和提取。目前，主要利用活性炭粉末、大孔樹(shù)脂和過(guò)氧化氫等對(duì)多糖進(jìn)行脫色[7]。采用活性炭脫色得到的多糖保留率較低，而采用過(guò)氧化氫進(jìn)行脫色可有效使有色物質(zhì)分解且不易復(fù)色，其多糖保留率也較高，成本低廉，試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單[8-10]。由于紅皮火龍果皮多糖含有較多色素，如何對(duì)得到的多糖進(jìn)行有效脫色也有一定困難。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有利用過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行脫色的報(bào)道。本研究以紅皮火龍果果皮為研究對(duì)象，采用過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行脫色，優(yōu)化多糖脫色的工藝條件，并研究紅皮火龍果皮多糖對(duì)細(xì)菌的抑菌活性，旨在為紅皮火龍果副產(chǎn)物的有效利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮火龍果：購(gòu)自蚌埠當(dāng)?shù)爻校?/p>

30%過(guò)氧化氫、95%乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大腸桿菌屬(Escherichiacoli)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌屬(Staphylococcusaureus)：蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；

LB固體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；

高速離心機(jī)：TGl16-C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9272型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：752型，上海光學(xué)儀器廠；

電子分析天平：FA1204C型，上海精密儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅皮火龍果皮多糖的制備 將新鮮紅皮火龍果洗凈，手工剝?nèi)☆伾迈r、無(wú)明顯疤痕的果皮于60 ℃干燥箱中干燥至恒重，粉碎過(guò)60目篩，得紅皮火龍果皮干燥粉末。精確稱取3.00 g紅皮火龍果果皮粉末(含粗脂肪0.16%，蛋白質(zhì)0.75%)置于索氏抽提器中進(jìn)行脫脂[11]，按照料液比1∶15(g/mL)的比例加入蒸餾水，于90 ℃提取1 h后，6 000 r/min離心10 min，得上清液。向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，6 000 r/min離心10 min，保留沉淀，用95%乙醇洗滌沉淀3次，合并沉淀，得到粗多糖。將粗多糖沉淀溶于100 mL蒸餾水，按 4∶1 的體積比加入Sevag 試劑[12]，使溶液充分混勻后，4 000 r/min離心5 min，進(jìn)行脫蛋白(重復(fù)3次)，向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，6 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，得到純化后的多糖(粗脂肪和蛋白質(zhì)徹底除去)。將多糖充分溶解于蒸餾水中得到多糖溶液。加入一定濃度的過(guò)氧化氫，置于恒溫水浴鍋中水浴脫色處理，6 000 r/min離心10 min，得上清液。向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，6 000 r/min離心10 min，收集沉淀，經(jīng)真空干燥后，得到紅皮火龍果皮多糖粉末。多糖得率和多糖保留率分別按式(1)、(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：

A——多糖得率，%；

m——多糖粉末的質(zhì)量，g；

M——紅皮火龍果皮粉末的質(zhì)量，g；

B——多糖保留率，%；

X0——脫色前多糖得率，%；

X1——脫色后多糖得率，%。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

(1) 過(guò)氧化氫濃度對(duì)多糖脫色的影響：取0.30 g紅皮火龍果皮多糖干粉溶于50 mL蒸餾水中，加入濃度為2%，3%，4%，5%，6%，7%的過(guò)氧化氫溶液，置于60 ℃恒溫水浴鍋中脫色2 h后，在450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算脫色率。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。脫色率按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

C——脫色率，%；

A1——過(guò)氧化氫脫色前450 nm處火龍果皮多糖溶液的吸光度；

A0——過(guò)氧化氫脫色后450 nm處火龍果皮多糖溶液的吸光度。

(2) 脫色溫度對(duì)多糖脫色的影響：設(shè)置脫色溫度為50，55，60，65，70，75 ℃，固定過(guò)氧化氫濃度為4%，脫色時(shí)間為2 h，每組試驗(yàn)重復(fù)3次?？疾烀撋珳囟葘?duì)多糖脫色率的影響。

(3) 脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色的影響：設(shè)置脫色時(shí)間為60，80，100，120，140，160 min，固定過(guò)氧化氫濃度為4%，脫色溫度為60 ℃，每組試驗(yàn)重復(fù)3次?？疾烀撋珪r(shí)間對(duì)多糖脫色率的影響。

1.2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響火龍果皮多糖脫色的顯著因素過(guò)氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以多糖脫色率為考察指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)。

1.2.4 抑菌活性試驗(yàn) 將脫色后的紅皮火龍果皮純多糖完全溶解于無(wú)菌水中，配置成濃度為10，20，40，80 mg/mL多糖溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，備用。挑取供試菌(大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)單菌落接入新鮮LB斜面培養(yǎng)基后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水制成活細(xì)胞濃度為106CFU/mL的菌懸液備用。采用濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定[13]。取0.2 mL菌懸液均勻涂布于凝固的瓊脂培養(yǎng)基中。將經(jīng)不同濃度的紅皮火龍果皮多糖溶液浸泡過(guò)的濾紙片，放置在含菌培養(yǎng)皿上，每個(gè)平皿放3片，并以浸泡過(guò)無(wú)菌生理鹽水的濾紙片作為對(duì)照。每一種菌重復(fù)3次，每個(gè)濃度作5個(gè)平行。于37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。

紅皮火龍果皮多糖對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定方法采用2倍稀釋法[14]。在測(cè)定4種供試菌抑菌活性所需多糖濃度的基礎(chǔ)上，將純多糖完全溶解于無(wú)菌水中，配置成濃度為1.875，3.750，7.500，15.000，30.000，45.000，60.000，120.000 mg/mL 多糖溶液，過(guò)0.22 μm濾膜。分別取1.0 mL 不同濃度的多糖溶液和0.2 mL活細(xì)胞濃度為106CFU/mL的菌懸液加入到培養(yǎng)皿中，再倒入40 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，凝固后，于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。以不加多糖的瓊脂培養(yǎng)基為對(duì)照，觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況，無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為紅皮火龍果皮多糖的最小抑制濃度。每一種菌重復(fù)3次，每個(gè)濃度做5次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化氫脫色單因素試驗(yàn)

2.1.1 過(guò)氧化氫濃度的影響 由圖1可知，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度從1%增加到4%時(shí)，紅皮火龍果皮多糖的脫色率顯著增加，而過(guò)氧化氫濃度由4%提高到6%時(shí)，多糖脫色率增加緩慢。由于高濃度的過(guò)氧化氫容易分解，因此在進(jìn)行過(guò)氧化氫稀釋時(shí)，盡量保持低溫。稀釋后的過(guò)氧化氫由于濃度下降而使反應(yīng)速率降低，從而減緩了過(guò)氧化氫的分解，利于提高過(guò)氧化氫利用效率。綜合考慮，取4%為適宜的過(guò)氧化氫濃度。

圖1 過(guò)氧化氫濃度對(duì)多糖脫色的影響

Figure 1 Effect of the hydrogen peroxide concentration on decolorization of polysaccharide

2.1.2 脫色溫度的影響 由圖2可知，隨著脫色溫度的升高，多糖脫色率逐漸增加；50～60 ℃時(shí)，多糖脫色率顯著增加，之后多糖脫色率增加不明顯?？紤]到紅皮火龍果皮多糖在高溫條件下活性可能會(huì)受損，選擇60 ℃為適宜脫色溫度。

2.1.3 脫色時(shí)間的影響 由圖3可以看出，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖脫色率升高；60～100 min時(shí)，多糖脫色率顯著增加，之后繼續(xù)延長(zhǎng)脫色時(shí)間，多糖脫色率不再增加?？紤]到節(jié)能等因素，選擇100 min為適宜的脫色時(shí)間。

圖2 脫色溫度對(duì)多糖脫色的影響Figure 2 Effect of the decolorization temperature on decolorization of polysaccharide

圖3 脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色的影響Figure 3 Effect of the decolorization time on decolorization of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化過(guò)氧化氫脫色工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取過(guò)氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時(shí)間為自變量，以多糖脫色率為響應(yīng)值，根據(jù)表1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results ofresponse surface analysis

根據(jù)表2所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-373.13+20.19A+11.32B+125C-0.04AB-0.01AC-2.5BC-1.9A2-0.09B2-4.81C2。

(4)

對(duì)表2的數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果見(jiàn)表3。由表2、3可知，得到的模型(P<0.000 1)顯著；失擬項(xiàng)不顯著(P=0.879 7>0.05)，表明該模型的擬合度較好；R2= 0.999 3，說(shuō)明此模型能解釋多糖脫色率99.93%的變異。一次項(xiàng)A、B和C極顯著(P<0.000 1)，表明過(guò)氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率影響極顯著。交互項(xiàng)(AB、AC、BC)和二次項(xiàng)(A2、B2、C2)影響均極顯著(P<0.000 1)，由F值大小可知，影響紅皮火龍果皮多糖脫色率主要因素主次順序?yàn)?C>B>A，即脫色時(shí)間>脫色溫度>過(guò)氧化氫濃度。

2.3 響應(yīng)面法分析

根據(jù)回歸方程，得出過(guò)氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。由圖4可知，當(dāng)固定脫色時(shí)間不變時(shí)，紅皮火龍果皮多糖的脫色率隨過(guò)氧

表3 方差分析表?Table 3 Variance analysis

化氫濃度和脫色溫度的升高，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。圖5表明，過(guò)氧化氫濃度和脫色時(shí)間對(duì)多糖的脫色率交互作用影響極顯著。當(dāng)固定脫色溫度不變時(shí)，多糖脫色率隨過(guò)氧化氫濃度的增加和脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先升后趨于平緩的趨勢(shì)。由圖6可知，當(dāng)固定過(guò)氧化氫濃度不變時(shí)，多糖脫色率隨脫色溫度和脫色時(shí)間的變化而變化，表現(xiàn)為先隨脫色溫度和脫色時(shí)間的增大而增大，當(dāng)多糖脫色率達(dá)到一定值后不再增加。

通過(guò)對(duì)回歸模型和響應(yīng)面進(jìn)行分析，確定采用過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行脫色的最佳工藝條件為：過(guò)氧化氫濃度4.32%，脫色溫度61.72 ℃，脫色時(shí)間109.04 min，在該條件下紅皮火龍果皮多糖的脫色率最大預(yù)測(cè)值為88.31%?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)條件，對(duì)最佳條件進(jìn)行了調(diào)整：過(guò)氧化氫濃度4.3%，脫色溫度62 ℃，脫色時(shí)間109 min，在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到紅皮火龍果皮多糖的實(shí)際脫色率為88.17%，平均誤差為1.97%(n=3)，實(shí)驗(yàn)值與理論值基本吻合。同時(shí)，測(cè)得紅皮火龍果皮多糖保留率為82.39%，平均誤差為1.52%(n=3)。結(jié)果表明該模型能有效預(yù)測(cè)過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行脫色的最佳工藝條件。

2.4 紅皮火龍果皮多糖的抑菌活性

由表4可以看出，紅皮火龍果皮多糖對(duì)4種供試菌都有一定的抑制作用，其抑菌活性隨多糖濃度的增加而不斷增強(qiáng)。

圖4 過(guò)氧化氫濃度和脫色溫度交互作用對(duì)多糖脫色率的影響Figure 4 Interaction effects of the hydrogen peroxide concentration (A) and the decolorization temperature (B) on the decolorization rate of the polysaccharide

圖5 過(guò)氧化氫濃度和脫色時(shí)間交互作用對(duì)多糖脫色率的影響Figure 5 Interaction effects of the hydrogen peroxide concentration (A) and the decolorization time (C) on the decolorization rate of the polysaccharide

圖6 脫色溫度和脫色時(shí)間交互作用對(duì)多糖脫色率的影響Figure 6 Interaction effects of the decolorization temperature (B) and the decolorization time (C) on the decolorization rate of the polysaccharide表4 紅皮火龍果皮多糖的抑菌結(jié)果?Table 4 Antibacterial activity results of the polysaccharide from red dragon fruit peel

多糖濃度/(mg·mL-1)抑菌圈直徑/mm大腸桿菌蠟樣芽孢桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌8017.4±0.3a16.7±0.3a13.6±0.3a12.8±0.2a4017.2±0.4a16.4±0.3a13.1±0.2a12.4±0.3a2013.4±0.3b12.1±0.2b11.3±0.2b10.8±0.1b1011.7±0.2c9.8±0.2c10.2±0.2c9.1±0.1c對(duì)照(無(wú)菌生理鹽水)0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0

? 同列不同字母表示差異顯著 (P<0.01)。

當(dāng)紅皮火龍果皮多糖濃度為20 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈分別為13.4，12.1 mm。當(dāng)紅皮火龍果皮多糖濃度為40 mg/mL時(shí)，紅皮火龍果皮多糖對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑均>15 mm，而對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均<15 mm?？傮w來(lái)看，紅皮火龍果皮多糖對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性強(qiáng)于枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。

由表5可知，紅皮火龍果皮多糖對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中多糖濃度為7.5 mg/mL時(shí)，未發(fā)現(xiàn)有大腸桿菌生長(zhǎng)，因此確定大腸桿菌最小抑制多糖濃度為7.500 mg/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中多糖濃度為30.000 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌不再生長(zhǎng)，因而金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為30.000 mg/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中多糖濃度為45.000 mg/mL 時(shí)，蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌不再生長(zhǎng)，確定蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑制多糖濃度為45.000 mg/mL。

表5 紅皮火龍果皮多糖的最小抑菌濃度?Table 5 Minimal inhibitory concentration (MIC) of the polysaccharide from red dragon fruit peel

? “+”表示有菌生長(zhǎng)，“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以紅皮火龍果為原料，采用過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行脫色，考察了過(guò)氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)紅皮火龍果皮多糖脫色的影響，確定過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行脫色的最佳工藝條件為：過(guò)氧化氫濃度4.3%，脫色溫度62 ℃，脫色時(shí)間109 min。紅皮火龍果皮多糖脫色率為88.17%，紅皮火龍果皮多糖保留率為82.39%。根據(jù)結(jié)果分析，采用過(guò)氧化氫法能對(duì)紅皮火龍果皮多糖進(jìn)行有效脫色，且多糖保留率較高。同時(shí)，如何進(jìn)一步采用過(guò)氧化氫對(duì)紅皮火龍果皮多糖脫色率和最大限度提高多糖保留率，仍有待進(jìn)一步研究。另外，紅皮火龍果皮多糖對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用。這些結(jié)果證實(shí)，紅皮火龍果皮多糖具有良好的殺菌作用，將紅皮火龍果皮多糖進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成食品添加劑具有良好的發(fā)展前景。

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