郎玉苗,孫寶忠,馬立新,張松山,謝 鵬,楊紅茹,李 翠

(1.河北大學,河北保定 071002; 2.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

蛋白質巰基亞硝基化(S-nitrosylation)是肉品科學領域中最新的研究熱點之一。蛋白質巰基亞硝基化是指一氧化氮(NO·)共價結合到蛋白質半胱氨酸殘基的巰基生成S-亞硝基半胱氨酸殘基(S-nitrosocysteine,SNO)的過程[1],是一種典型的氧化還原依賴的蛋白翻譯后修飾,影響蛋白質在細胞內的構象、活性和功能[2-3],且與衰老、腫瘤[4-5]、炎癥[6-7]、肌營養(yǎng)不良[8]、阿爾茨海默病[9]、帕金森病[10]等人類疾病和健康密切相關[11]。然而,蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質影響的研究卻很少。

鮮肉的品質可分為外觀品質特性(如肉色、脂肪含量和分布、脂肪色、肉表面的汁液量、貯藏損失和質地)、食用品質特性(如嫩度、風味和多汁性)和信譽品質特性(如安全、營養(yǎng)、動物福利、道德倫理、原產地和產品商標或品牌等)。隨著消費者生活水平的提高,消費者對高品質肉的需求逐漸增加,肉品加工企業(yè)應持續(xù)生產和提供高品質肉(美味、安全和健康)來確保肉品的持續(xù)消費[12]。已有研究表明,蛋白質巰基亞硝基化與肉品嫩度、肉色等肉品質有關[13],但相關研究卻很少,其具體作用機制仍不明確。本文綜述了蛋白質巰基亞硝基化的概念、分子機制及影響因素,并說明其對肉品品質的影響,為改善和提高肉品品質奠定理論基礎。

1 蛋白質巰基亞硝基化概念

蛋白質巰基亞硝基化的概念是由Stamler于1994年首次提出,指一氧化氮(NO·)共價結合到蛋白質半胱氨酸殘基的巰基生成S-亞硝基半胱氨酸殘基(S-nitrosocysteine,SNO)的過程[4]。此后大量研究發(fā)現(xiàn),巰基亞硝基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾,也是一種可逆的氧化還原反應,其影響蛋白質的結構,進而影響其功能和活性[2],在細胞信號轉導調控中發(fā)揮重要作用[14]。與其它的蛋白翻譯后修飾有所不同,蛋白質巰基亞硝基化既是一種信號通路調控機制,也可以通過翻譯后修飾蛋白質來調控蛋白質功能而發(fā)揮作用[4]。Jain等[2]研究表明太陽花幼苗的巰基亞硝基化或去亞硝基化修飾作用是調控其鹽脅迫應激的一種機制。Yang等[11]研究表明肥胖小鼠的肌醇需要蛋白-1(inostitol-requiring protein-1,IRE1α)的巰基亞硝基化程度增加了,被修飾的IRE1α能降低RNA酶活性。雖然蛋白質巰基亞硝基化修飾只是眾多蛋白翻譯后修飾中的一種,但其重要性不容忽視。然而,由于蛋白質巰基亞硝基化檢測和亞硝基化位點的鑒定難度大,Swiss-Prot和TrEMBL數(shù)據庫中有關蛋白質巰基亞硝基化的數(shù)據很少[5],而針對蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質的研究就更少[15]。因此,應加快蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質影響及機理的研究,為從蛋白質巰基亞硝基化角度改善肉品品質奠定理論基礎。

2 蛋白質巰基亞硝基化的分子機制

2.1 蛋白質巰基亞硝基化的反應機理

2.2 一氧化氮合成酶活性及其影響因素

生物體內一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)有3個亞類,即神經型一氧化氮合成酶(neuronal NOS,nNOS)、內皮型一氧化氮合成酶(endothelial NOS,eNOS)和誘導型一氧化氮合成酶(inducible NOS,iNOS)[19]。骨骼肌中以nNOS為主,nNOS通過與營養(yǎng)不良相關蛋白1-互養(yǎng)蛋白鍵合而附著在膜表面。骨骼肌中NO是精氨酸在NOS作用下轉化為瓜氨酸的過程中產生的[20]。因NO具有脂溶性,其可以跨膜轉導細胞信號,因此廣泛參與心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的生理和病理過程[5]。Brannan等[21]研究結果顯示宰后24 h的豬隔膜中NOS仍有活性,并且NOS的活性在pH4.5～7.4是穩(wěn)定的。Liu等[22]報道了宰后1 d豬背最長肌、腰大肌和半膜肌中均具有NOS活性,而宰后3 d半膜肌仍存在活性;NOS活性為半膜肌>背最長肌>腰大肌;NOS活性與IIA/X型肌纖維比例正相關,與IIB型肌纖維比例負相關。

NOS的表達量或活性受多種因素影響,nNOS的分布與物種和肌纖維有關，如人體中慢收縮型肌纖維中NOS的含量要比快收縮型肌纖維中多,而在老鼠肌肉中卻有相反的表達模式。NOS的表達受底物濃度、輔助因子和蛋白修飾等多種因素調控。哺乳動物體內的精氨酸酶(L-arginine)病理性的升高會導致NO缺乏而使動物的蛋白質巰基亞硝基化水平降低,進而出現(xiàn)一些病理現(xiàn)象,如氣道高反應性。然而,動物體內NO含量過高,會產生細胞毒性而引起細胞凋亡。NOS是一種氧化還原酶,其發(fā)揮作用需要氧、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)、四氫蝶呤、黃素嘌呤單核苷酸和黃素嘌呤二核苷酸作為輔因子參與[23],這些輔助因子的濃度也會影響NOS的活性。eNOS和nNOS的活性受Ca2+、鈣調蛋白濃度和活性的影響,體內Ca2+釋放使Ca2+與鈣調蛋白結合,從而激活NOS。此外,NOS的磷酸化也影響NOS的活性,nNOS被磷酸化后其酶活性降低[24]。由此可見,影響NOS活性的因素很多,可通過改變這些影響因素條件來調控NOS活性,進而調控蛋白質巰基亞硝基化修飾作用。

2.3 影響蛋白質巰基亞硝基化的因素

細胞內主要的NO供體是亞硝基谷胱甘肽,其可以將NO反式轉移到蛋白質半胱氨酸巰基上,發(fā)生轉亞硝基化作用。細胞內NO濃度、亞硝基谷胱甘肽濃度及蛋白質所處的氧化還原狀態(tài)共同決定了蛋白質巰基亞硝基化修飾作用[25]。此外,蛋白質的空間結構及其修飾位點所處的微環(huán)境(如疏水性、pKa、Ca2+濃度和半胱氨酸的暴露特性等)均會影響蛋白質巰基亞硝基化作用[4,26-27]。影響蛋白質巰基亞硝基化修飾作用的因素很多,這可能也是蛋白質巰基亞硝基化機理仍不明確的原因之一。

3 蛋白質巰基亞硝基化與宰后成熟的關系

3.1 蛋白質巰基亞硝基化與宰后成熟相關蛋白酶

宰后成熟是提高肉品嫩度,整體改善肉品品質的重要措施之一。宰后成熟過程中肉品品質的改善主要是由于鈣蛋白酶體系(calpain)、組織蛋白酶(cathepsin)、溶酶體(lysosome)和細胞凋亡酶(caspase)等肌肉內源酶系對骨骼肌骨架蛋白和肌原纖維蛋白的有限降解[13]。研究表明,鈣蛋白酶的巰基亞硝基化修飾能活化鈣離子通道、影響鈣蛋白酶的活性[2]。μ-calpain是一種半胱氨酸蛋白酶,其在催化亞基部分含有11個半胱氨酸殘基,在小亞基部分含有2個半胱氨酸殘基。在pH5.5時鈣蛋白酶與NO強化劑孵化時,80%的鈣蛋白酶催化活性受到抑制[13]。μ-calpain活化位點半胱氨酸殘基的巰基亞硝基化修飾能夠影響其自溶解和蛋白水解活性,進而影響宰后成熟過程中肉品質變化[28]。Liu等[2]研究了試管中不同濃度亞硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione,GSNO)對μ-calpain自溶解和催化活性的影響,結果顯示蛋白質巰基亞硝基化負向調控μ-calpain活性;μ-calpain的半胱氨酸殘基的催化基團的49、351、384和592位點以及小基團的142位點被巰基亞硝基化修飾。此外,蛋白質巰基亞硝基化修飾影響細胞凋亡酶的活性,caspase-3發(fā)生去硝基化會被激活,進而誘導細胞凋亡[29-31]。由此可見,蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質產生影響極有可能是通過調控宰后成熟相關酶活性(如調控鈣離子通道、鈣蛋白酶活性及細胞凋亡酶活性)來實現(xiàn)的。

3.2 蛋白質巰基亞硝基化與宰后糖酵解

動物宰后由于血液循環(huán)終止,肌細胞出現(xiàn)缺氧,能量代謝由有氧代謝轉為無氧代謝(即糖酵解),此時糖原代謝為乳酸并在肌肉中蓄積,使宰后肌肉的pH下降[32]。而宰前應激狀況、宰后肌肉溫度和糖酵解相關酶活性均會影響宰后pH下降速率和終點pH,進而影響宰后成熟肉品質的形成。研究表明,蛋白質巰基亞硝基化對宰前糖代謝和宰后糖酵解有影響。Cottrell等[33]研究了注射L-NAME(NO合成抑制劑)組和運動組(刺激產生NO)的背最長肌和半膜肌宰后成熟過程中糖酵解變化,結果顯示注射L-NAME改變了宰前羊的糖代謝,并且注射L-NAME抑制NO產生能增加宰后糖酵解。劉瑞等[15]研究結果顯示，參與宰后糖酵解的酶均可被巰基亞硝基化修飾,其中亞硝基化修飾的甘油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸果糖激酶的活性會受到抑制。由此可見,蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質的影響極有可能與宰后糖酵解相關酶的巰基亞硝基化修飾有關。

4 蛋白質巰基亞硝基化與肉品品質的關系

4.1 蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質的影響

關于蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質的影響已有相關報道。Cook等[34]報道了宰后2 h注射NO促進劑和NO抑制劑到牛背最長肌中能夠影響成熟2～6 d時的牛肉嫩度。Cottrell等[33]研究結果顯示注射L-NAME能降低背最長肌的剪切力值,而對半膜肌的剪切力無影響,改善背最長肌的嫩度。Zhang等[35]研究了NO對宰后成熟過程中雞胸肉的品質影響,其將實驗分為對照組、NO合成抑制組(NOS)和NO加強組并在4 ℃成熟7 d,結果顯示NO濃度影響冷藏保存中雞胸肉的脂肪氧化、蛋白質氧化和品質特性。Li等[28]研究結果顯示NOS抑制處理組的肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白的降解增加,蛋白質巰基亞硝基化影響宰后肌原纖維蛋白的降解。此外,蛋白質巰基亞硝基化可促進細胞生成熱休克蛋白HSP70和HSP32。其中,肌肉中的HSP70的表達與嫩度有直接關系,HSP70的高表達能夠延緩肌肉的嫩度[36]。以I型肌纖維為主的肌肉(腰大肌)和以II型肌纖維為主的肌肉(背最長肌)的蛋白質巰基亞硝基化存在差異[23]。由此可見,可以通過調控蛋白質巰基亞硝基化作用來改善肉品品質,特別是肉品嫩度。上述研究表明,蛋白質巰基亞硝基化不僅可以調控鈣離子通道、鈣蛋白酶活性及細胞凋亡酶活性,還能調控肌肉收縮、能量代謝和蛋白酶活性[33,35]。

4.2 蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質影響的潛在機制

大量研究表明,宰后能量代謝、鈣離子釋放、鈣蛋白酶及細胞凋亡酶活性能影響宰后肌肉蛋白的降解,進而影響肉品品質的形成。Huang等[37]研究了注射Ca2+和Zn2+對宰后牛骨骼肌中caspase-3活性和嫩度的影響,結果顯示Ca2+加快了宰后嫩化速率而Zn2+延緩了這一進程,同時Ca2+刺激了細胞色素C的釋放并提高了caspase-3的活性。Smit等[38]研究結果顯示高壓處理能夠抑制宰后糖酵解進而提高肉品品質。Santos等[39]研究了宰后早期pH下降和成熟對牛肉嫩度和持水力的影響,結果顯示中等速率的糖酵解能降低背最長肌的剪切力值,快速糖酵解的肉品質最好。Choe等[40]研究了放血、宰后肌肉代謝與豬肉品質特性的關系,結果顯示影響豬肉品質特性的主要因素是肌肉中通過宰后糖酵解產生的終點乳酸含量,血中葡萄糖和乳酸水平以及宰后肌肉中糖原和乳酸水平能夠解釋大部分的豬肉品質特性。Zhao等[41]研究了宰后7 d內雞胸肉的品質特性、蛋白水解與鈣蛋白酶的關系,結果顯示宰后12 h內μ-calpain與豬肉品質特性和蛋白水解有強相關,宰后12 h～7 d μ-calpain在肉品質變化中起重要作用,而μ/m-calpain對蛋白水解和肉品質變化的影響較小。Biswas等[42]指出了calpain體系對宰后嫩化過程和肉品質的形成具有重要作用,并且最終嫩度的形成決定于內源性酶對關鍵肌原纖維蛋白的水解程度。

雖然關于蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質影響的研究越來越多,但其機理仍不清楚。通過對已有研究結果的分析可以初步推測蛋白質巰基亞硝基化對肉品品質的機理,即蛋白質巰基亞硝基化可調控宰后肌肉鈣離子濃度、能量代謝和蛋白水解相關酶活性,進而影響宰后肌肉中肌原纖維蛋白的水解,最終影響肉品品質。

5 展望

近年來,對蛋白質巰基亞硝基化機理方面的研究越來越多,關于其對肉品質的影響也逐漸受到肉品科學專家的關注。由于蛋白質巰基亞硝基化影響因素多、調控網絡復雜以及現(xiàn)有研究技術手段的限制,其作用機理仍有待進一步細致的研究。隨著新技術、新方法的開發(fā)的利用,未來可采用一些高通量的技術(如蛋白質組學)進一步研究亞硝基化修飾的作用機制。蛋白質巰基亞硝基化可通過調節(jié)鈣離子通道、蛋白水解相關酶活性、糖酵解等多種途徑影響宰后肌肉中蛋白水解,進而影響肉品品質的形成。因此,對蛋白質巰基亞硝基化影響肉品品質作用機理的研究,要從多角度進行綜合研究,為從蛋白質巰基亞硝基化角度改善肉品品質提供重要的理論依據。

[1]Tsikas D,B?hmer A. S-Transnitrosation reactions of hydrogen sulfide(H2S/HS-/S2-)with S-nitrosated cysteinyl thiols in phosphate buffer of pH7.4:Results and review of the literature[J]. Nitric Oxide,2017,65:22-36.

[2]Liu R,Li Y,Wang M,et al. Effect of protein S-nitrosylation on autolysis and catalytic ability of μ-calpain[J]. Food Chemistry,2016,213:470-477.

[3]Jain P,von Toerne C,Lindermayr C,et al. S-nitrosylation/denitrosylation as a regulatory mechanism of salt stress sensing in sunflower seedlings[J]. Physiologia Plantarum,2018,162(1):49-72.

[4]石婷,陳銘,陳雄平,等. 蛋白質巰基亞硝基化分子機制及其疾病相關性[J]. 化學進展,2015,27(5):594-600.

[5]梁娟. 蛋白質巰基亞硝基化反應機理的理論研究[D]. 上海:上海交通大學,2011.

[6]Foley T D,Koval K S,Olsen S H,et al. Protein S-nitrosylation:Possible links between psychophysiological stress and neurodegeneration[J]. Free Radical Biology and Medicine,2017,112:73-74.

[7]Yang L,Calay E S,Fan J,et al. S-Nitrosylation links obesity-associated inflammation to endoplasmic reticulum dysfunction[J].Science,2015,349(6247):500-506.

[8]Chung H S,Kim G E,Holewinski R J,et al. Transient receptor potential channel 6 regulates abnormal cardiac S-nitrosylation in Duchenne muscular dystrophy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2017,29:E10763-E10771.

[9]Di Domenico F,Barone E,Perluigi M,et al. The triangle of death in Alzheimer’s disease brain:the aberrant cross-talk among energy metabolism,mammalian target of rapamycin signaling,and protein homeostasis revealed by redox proteomics[J]. Antioxidants & Redox Signaling,2017,26(8):364-387.

[10]Oh C K,Sultan A,Platzer J,et al. S-Nitrosylation of PINK1 attenuates PINK1/Parkin-dependent mitophagy in hiPSC-Based parkinson’s disease models[J]. Cell Reports,2017,21(8):2171-2182.

[11]Akhtar M W,Sanz-Blasco S,Dolatabadi N,et al. Elevated glucose and oligomericβ-amyloid disrupt synapses via a common pathway of aberrant protein S-nitrosylation[J]. Nature Communications,2016,7:10242.

[12]郎玉苗. 肌纖維類型對牛肉嫩度的影響機制研究[D]. 北京:中國農業(yè)科學院,2016.

[13]李玉品. 蛋白質亞硝基化對宰后豬肉鈣蛋白酶系統(tǒng)和蛋白質降解的影響[D]. 南京:南京農業(yè)大學,2015.

[14]Lamotte O,Bertoldo J B,Besson-Bard A,et al. Protein S-nitrosylation:specificity and identification strategies in plants[J]. Frontiers in Chemistry,2015,2:114.

[15]劉瑞,周光宏,張萬剛. 一氧化氮和蛋白質亞硝基化對鮮肉品質的影響研究進展[J]. 中國畜牧雜志,2017,53(4):1-2.

[16]Foster M W,McMahon T J,Stamler J S. S-nitrosylation in health and disease[J]. Trends in Molecular Medicine,2003,9(4):160-168.

[17]Kundu D,Abraham D,Black C M,et al. Reduced levels of S-nitrosothiols in plasma of patients with systemic sclerosis and Raynaud’s phenomenon[J]. Vascular Pharmacology,2014,63(3):178-181.

[18]Gow A J,Buerk D G,Ischiropoulos H. A novel reaction mechanism for the formation of S-nitrosothiolinvivo[J]. Journal of Biological Chemistry,1997,272(5):2841-2845.

[19]Du L,He F,Kuang L,et al. eNOS/iNOS and endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in the placentas of patients with preeclampsia[J]. Journal of Human Hypertension,2017,31(1):49-55.

[20]Papuc C,Goran G V,Predescu C N,et al. Mechanisms of oxidative processes in meat and toxicity induced by postprandial degradation products:A review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2017,16(1):96-123.

[21]Brannan R G,Decker E A. Nitric oxide synthase activity in muscle foods[J]. Meat Science,2002,62(2):229-235.

[22]Liu R,Li Y,Zhang W,et al. Activity and expression of nitric oxide synthase in pork skeletal muscles[J]. Meat Science,2015,99:25-31.

[23]Zhang W. Involvement of protein degradation,calpain autolysis and protein nitrosylation in fresh meat quality during early postmortem refrigerated storage[D]. Iowa:Iowa State University,2009.

[24]黃波,陳暢. 一氧化氮的功能及其作用機制(I)——性質與功能[J]. 生物物理學報,2012,28(3):173-184.

[25]Tada Y,Spoel S H,Pajerowska-Mukhtar K,et al. Plant immunity requires conformational charges of NPR1 via S-nitrosylation and thioredoxins[J]. Science,2008,321(5891):952-956.

[26]Marino S M,Gladyshev V N. Structural analysis of cysteine S-nitrosylation:a modified acid-based motif and the emerging role of trans-nitrosylation[J]. Journal of Molecular Biology,2010,395(4):844-859.

[27]Doulias P T,Greene J L,Greco T M,et al. Structural profiling of endogenous S-nitrosocysteine residues reveals unique features that accommodate diverse mechanisms for protein S-nitrosylation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(39):16958-16963.

[28]Li Y,Liu R,Zhang W,et al. Effect of nitric oxide on μ-calpain activation,protein proteolysis,and protein oxidation of pork during post-mortem aging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(25):5972-5977.

[29]Nakamura T,Lipton S A. Aberrant nitric oxide signaling contributes to protein misfolding in neurodegenerative diseases via S-Nitrosylation and tyrosine nitration[M].Nitric Oxide(Third Edition),2017:373-384.

[30]Saligrama P T,Fortner K A,Secinaro M A,et al. IL-15 maintains T-cell survival via S-nitrosylation-mediated inhibition of caspase-3[J]. Cell Death & Differentiation,2014,21(6):904-914.

[31]Wu W,Wan O W,Chung K KK. S-nitrosylation of XIAP at Cys 213 of BIR2 domain impairs XIAP’s anti-caspase 3 activity and anti-apoptotic function[J]. Apoptosis,2015,20(4):491-499.

[32]Li Y J,Gao T,Li J L,et al. Effects of dietary starch types on early postmortem muscle energy metabolism in finishing pigs[J]. Meat Science,2017,133:204-209.

[33]Cottrell J J,McDonagh M B,Dunshea F R,et al. Inhibition of nitric oxide release pre-slaughter increases post-mortem glycolysis and improves tenderness in ovine muscles[J]. Meat Science,2008,80(2):511-521.

[34]Cook C J,Scott S M,Devine C E. Measurement of nitric oxide and the effect of enhancing or inhibiting it on tenderness changes of meat[J]. Meat Science,1998,48(1-2):85-89.

[35]Zhang W,Marwan A H,Samaraweera H,et al. Breast meat quality of broiler chickens can be affected by managing the level of nitric oxide[J]. Poultry Science,2013,92(11):3044-3049.

[36]Bjarnadóttir S G,Hollung K,H?y M,et al. Changes in protein abundance between tender and tough meat from bovine muscle assessed by isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation(iTRAQ)and 2-dimensional gel electrophoresis analysis[J]. Journal of Animal Science,2012,90(6):2035-2043.

[37]Huang F,Ding Z,Zhang C,et al. Effects of calcium and zinc ions injection on caspase-3 activation and tenderness in post-mortem beef skeletal muscles[J]. International Journal of Food Science & Technology,2017.

[38]Smit N R,Summerfield J W,Cannon J E. Use of high pressure processing to improve muscle quality by inhibiting post mortem glycolysis:U.S.,9713337[P]. 2017-7-25.

[39]Santos C,Moniz C,Roseiro C,et al. Effects of early post-mortem rate of pH fall and aging on tenderness and water holding capacity of meat from cull dairy holstein-friesian cows[J]. Journal of Food Research,2016,5(2):1.

[40]Choe J H,Choi M H,Ryu Y C,et al. Estimation of pork quality traits using exsanguination blood and postmortem muscle metabolites[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2015,28(6):862.

[41]Zhao L,Xing T,Huang J,et al. Involvement of μ/m-calpain in the proteolysis and meat quality changes during postmortem storage of chicken breast muscle[J]. Animal Science Journal,2017. doi:10.1111/asj. 12921.

[42]Biswas A K,Tandon S,Giri A K,et al. Role of calpain system in post-mortem tenderization of meat and its influence on quality-A review[J]. Indian Journal of Poultry Science,2016,51(2):123-131.