王鳳軍,葉素丹，*,陳冠武，包永華

(1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310018；2.汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭 515000)

《2016年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢》報告顯示轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大,為9140萬公頃,占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的一半。轉(zhuǎn)入大豆中的基因種類較多,大致可分為:改善品質(zhì)、抗蟲、抗旱、除草、抗病、高產(chǎn)等幾個方向[1]。截止2011年,全球共有19個轉(zhuǎn)基因大豆獲得批準(zhǔn)商業(yè)化種植,包括1個抗蟲、3個高油、11個耐除草劑、1個抗蟲耐除草劑、3個耐除草劑高油轉(zhuǎn)基因大豆。我國是大豆和大豆制品進口國,國內(nèi)需求不斷增加。目前為止,被批準(zhǔn)進入中國的轉(zhuǎn)基因大豆品系只有10種(A2704-12、A5547-127、CV127、DP305423、DP305423×GTS40-3-2、DP356043、GTS40-3-2、MON87701、MON87701×MON89788、MON89788)[1]。

轉(zhuǎn)基因生物可以獲得高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品，這可解決人類糧食短缺,饑餓,貧窮等生存問題,但同時關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的安全擔(dān)憂也層出不窮[2-5],轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性和合理性爭議一直伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展歷程,因此對作物轉(zhuǎn)基因成分進行檢測也顯得尤為重要。目前轉(zhuǎn)基因作物檢測主要以PCR方法為主,根據(jù)轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化時慣用的啟動子如花椰菜花葉病毒啟動子(P-35S)、胭脂堿合成酶終止子(T-NOS)以及外源啟動子或終止子與作物基因組的交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因等設(shè)計合成特異性引物,用體外擴增的方法定性檢測轉(zhuǎn)基因作物樣品[6]。該方法操作簡便,耗時短,可以建立針對某種作物的標(biāo)準(zhǔn)化檢測體系,主要有常規(guī)定性PCR法、巢式PCR法,等溫擴增法和實時熒光定量PCR法等[7-10]。如朱琳峰等[11]使用LAMP檢測方法對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆Cp4-epsps基因進行檢測;付海濱和錢云開等[12-13]使用實時熒光PCR對轉(zhuǎn)基因大豆的品系進行鑒定。這些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法常常局限于單一基因,檢測范圍窄,效率低,迫切需要開發(fā)高通量快捷性的多重?zé)晒釶CR檢測方法[14-15]。

本研究通過多重引物和熒光探針組合篩選,反應(yīng)體系優(yōu)化,特異性、重復(fù)性和靈敏性測試以及樣品適用性驗證檢測等過程開發(fā)建立了二重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù),該技術(shù)可實現(xiàn)一個反應(yīng)管中同時檢測兩個靶標(biāo)基因,降低試劑成本,縮短檢測時間,提高檢測效率，為大豆及其深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測提供了有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品 深圳安萊爾科技公司;CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J213 均為CNAS能力驗證樣品;其他用于適用性檢測的大豆及其深加工制品等樣品 均購于市場。

通用型基因組DNA小量制備試劑盒(Koning) 杭州百邁生物股份有限公司;AceTaq?DNA聚合酶(Vazyme)、dNTP mix(10 mM each)、10×PCR Buffer(AceTaq)(Mg2+plus)、PBS 南京諾唯贊生物科技公司;探針與引物 委托美國Invitrogen公司合成;AB7500熒光定量PCR儀 美國ABI公司;NanoDrop 核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 稱取干重樣品40 mg或濕重樣品150 mg,按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作,加入50 μL滅菌雙重蒸餾水洗脫兩次。提取后取 1 μL 用核酸蛋白分析儀測定提取的基因組 DNA的濃度和純度,用滅菌雙重蒸餾水將所有樣品標(biāo)定至100 ng/μL,保存于-20 ℃待用。

1.2.2 引物和探針設(shè)計 在NCBI網(wǎng)頁檢索轉(zhuǎn)基因大豆常用外源基因P-35S和T-NOS,根據(jù)多重實時熒光PCR檢測引物設(shè)計與篩選的原則,使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計多重引物和熒光探針。探針分別使用熒光基團FAM和Cy5作為發(fā)光基團,使用BHQ作為非熒光淬滅基團。在DNAstar軟件上評價引物和探針的特異性,在BLAST網(wǎng)頁上比對擴增產(chǎn)物的特異性。檢測引物和探針使用滅菌雙重蒸餾水稀釋至10 μmol/L備用。

1.2.3 二重?zé)晒釶CR反應(yīng) 20 μL二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中包括Taq酶,dNTP,基因組DNA以及2組檢測引物和探針等成分(具體見表1)。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃預(yù)變性15 s;95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸1 min,進行40個循環(huán)。定量中設(shè)置陰陽性對照、三個復(fù)孔的重復(fù)實驗和空白對照實驗。陽性對照中使用轉(zhuǎn)基因陽性的大豆DNA模板,陰性對照中使用轉(zhuǎn)基因陰性的大豆DNA模板,空白對照中不加DNA模板,而以滅菌蒸餾水代替,用于檢驗是否存在PCR污染和較高的引物二聚體污染。實驗結(jié)果應(yīng)用ABI 7500 software v2.3進行分析處理。

表1 二重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)混合液組成Table 1 Reaction mix for mutiplex real-time PCR systems

1.2.4 特異性檢測 提取ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆樣本以及CNAS T025-30非轉(zhuǎn)基因大豆樣本基因組DNA,使用上述二重?zé)晒舛縋CR體系進行轉(zhuǎn)基因成分檢測與判定,驗證方法的特異性。

1.2.5 靈敏性檢測 提取10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆樣本基因組DNA,用基因組DNA提取時所用的洗脫液進行梯度稀釋,按照10倍濃度稀釋5個梯度,分別為23.000、2.300、0.230、0.023、0.0023 ng/μL。根據(jù)大豆的單倍體基因組分子重量約為1.15 pg[16],稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為20000、2000、200、20和2拷貝/μL,對5個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進行二重實時熒光定量反應(yīng),每個濃度設(shè)置3 個重復(fù),驗證方法的靈敏性。

1.2.6 適用性檢測 采用上述大豆轉(zhuǎn)基因成分二重?zé)晒舛縋CR檢測方法對實驗室收集的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品,以及中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)組織的能力驗證樣品等已知樣品進行檢測,并對市場上購買的大豆及其深加工制品等流通產(chǎn)品,共27個批次進行檢測。同時驗證方法的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取結(jié)果

提取得到的DNA溶液經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測,OD(260 nm/280 nm)大于1.5,OD(260 nm/230 nm)大于1.0,含量為在100 ng/L以上,純度和提取效率較好。使用0.7% 瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰,完整性好,可用于實時熒光PCR檢測。

圖1 ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆樣本以及CNAS T025-30非轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取結(jié)果Fig.1 The results of DNA isolation from ACAS-T067-J213 transgenic soybean samples and no-transgenic soybean CNAS T025-30注:1:ACAS-T067-J213; 2:CNAS T025-30;M:1ku DNA Ladder。

2.2 引物和探針特異性檢測

按照1.2.2中的方法針對轉(zhuǎn)基因大豆常用的P-35S啟動子和T-NOS終止子各設(shè)計2～3對引物和探針,探針5′ 熒光染料標(biāo)記根據(jù)所采用的實時熒光PCR儀的配置和熒光基團的發(fā)射光譜或者吸收光譜而定,探針的3′ 淬滅集團為非熒光標(biāo)記,合成后探針進行擴增驗證,篩選出特異性好的引物和探針用于后續(xù)實驗。篩選的引物和探針信息見表2。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆特異性檢測的引物和探針序列Table 2 The primers and probes of transgenic soya

2.3 特異性檢測結(jié)果

使用上述的二重實時熒光定量PCR體系對轉(zhuǎn)基因大豆陽性樣本和轉(zhuǎn)基因大豆陰性樣本進行轉(zhuǎn)基因成分檢測,以驗證方法的特異性。結(jié)果表明,在ACAS-T067-J213、CNAS T025-24、CNAS T0659-23、CNAS T0659-79、CNAS T0659-104、CNAS T0659-175等轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因P-35S啟動子和T-NOS終止子檢出,且擴增曲線呈現(xiàn)明顯的S型(其中ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆的擴增曲線見圖2)。CNAS T0659-74、CNAS T025-30等非轉(zhuǎn)基因大豆種子二重?zé)晒釶CR檢測中P-35S和T-NOS均未檢出,空白對照均無信號,檢測基因之間無信號干擾,外源基因的反應(yīng)結(jié)果與期望結(jié)果一致,表明建立的二重實時熒光PCR具有較好的特異性。

圖2 ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆樣本中外源基因P-35S和T-NOS二重?zé)晒釶CR反應(yīng)的擴增曲線圖Fig.2 The amplification plots obtained for simultaneous amplification of P-35S and T-NOS

2.4 靈敏性檢測結(jié)果

以拷貝數(shù)的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo),以循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo)做外源基因P-35S和T-NOS的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3),其中R2分別為0.997和0.996。10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆單重和多重?zé)晒舛縋CR檢測相對靈敏性分析見表3,可見本研究建立的二重實時熒光PCR與單重實時熒光PCR的穩(wěn)定性和靈敏性相當(dāng)。在二重實時熒光PCR檢測中,檢測同一參照樣品重復(fù)間Ct值變異較小,外源基因P-35S的Ct值變化范圍在19.23～34.09之間,標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.202～0.789之間,擴增效率為93%;外源基因T-NOS的Ct值變化范圍在22.73～35.69之間,標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.397～0.910之間,擴增效率為91%,最低檢測限為2拷貝/μL,表明本研究建立的二重實時熒光PCR檢測方法靈敏性較高,能夠滿足篩選檢測轉(zhuǎn)基因大豆及其制品中轉(zhuǎn)基因成分的需要。

表3 10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆單重和多重?zé)晒舛縋CR檢測相對靈敏性分析Table 3 The relative sensitivity analyses of single and multiplex qPCR systems used in detention of 10% Roundup Ready transgenic soya reference materials

圖3 10% Roundup Ready transgenic soybean樣品中P-35S和T-NOS基因二重?zé)晒釶CR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curves of detected genes of P-35S and T-NOS from 10% Roundup Ready transgenic soybean in duplex qPCR assay

2.5 適用性檢測結(jié)果

對采自農(nóng)貿(mào)市場的2批大豆和豆腐、腐竹、老豆干、素雞、腐乳、素肉串、豆奶、豆?jié){、豆腐腦、豆瓣醬、豆卷、板筋等12種大豆制品25個批次樣品,以及實驗室保存的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品和能力驗證剩余樣品進行二重實時熒光PCR和內(nèi)源基因Letin的檢測,其中Letin基因均被檢出,保證了核酸提取的有效性,不會出現(xiàn)假陰性檢測結(jié)果。同時按照使用較多的標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204-2003[17]和GB/T 19495.5-2004[18]中規(guī)定的單重實時熒光PCR對外源基因P-35S和T-NOS進行篩選檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用建立的二重實時熒光PCR檢測方法,2個批次的大豆樣本中P-35S和T-NOS兩個靶標(biāo)基因均未檢出,而在其25個批次的大豆制品中只有2個腐竹樣本檢出了兩個靶標(biāo)基因(見表4),檢出率為7.4%,與標(biāo)準(zhǔn)中的方法檢測結(jié)果一致,采自于市場的27個批次的樣本和實驗室保存的9個標(biāo)準(zhǔn)品以及能力驗證剩余樣品均未出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果,表明建立的二重實時熒光PCR檢測方法具有很好的適用性。

表4 農(nóng)貿(mào)市場大豆及其制品抽樣檢驗中轉(zhuǎn)基因檢測陽性結(jié)果匯總表Table 4 The summary table of the transgenic positive results of in the soybeans and their products from the farmers markets

3 結(jié)論

本研究建立的二重?zé)晒釶CR技術(shù)可同時對P-35S,T-NOS兩個外源基因進行檢測,為保證方法的準(zhǔn)確性,通過了特異性、重復(fù)性和靈敏性的驗證,確保了該方法在同時檢測兩個靶標(biāo)基因時,無熒光信號的相互干擾,不會出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果;通過對比優(yōu)化實驗,摸索出二重?zé)晒舛縋CR檢測的最佳反應(yīng)體系,擴增效率在90%～110%之間;通過梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2大于0.98,確定了最低檢測限為2拷貝/μL。通過對27個批次的樣品進行轉(zhuǎn)基因成分篩選測試,結(jié)果與預(yù)期的一致,顯示該方法有較好的適用性。開發(fā)和建立的二重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)可為大豆及其深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的快速篩選檢測提供了有效方法,可用于口岸和市場流通大豆樣品的篩選檢測。

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