張彥軍,洪 霞,周鑫魁,柴宗龍,王杰斌,袁彩霞,賈亞莉,錢瀅文,*

(1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅蘭州 730010; 2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司,甘肅蘭州 730010)

苯醚甲環(huán)唑又名惡醚唑,是一種三唑類殺真菌劑,在三唑類殺菌劑中占有極重要的地位,已經成為蔬菜種植中使用最廣泛的殺菌劑之一。其內吸性強,殺菌譜廣,通過抑制麥角甾醇(構成細胞膜的重要成分,對細胞膜的滲透性起重要作用)的生物合成,破壞細胞膜結構功能,從而達到殺菌目的,對蔬菜多種真菌性病害具有很好的保護和治療作用[1-2]。苯醚甲環(huán)唑殘留于蔬菜中通過食用進入人體,累積后可能會危害人體健康。Li等[3]用熒光光譜法測定了苯醚甲環(huán)唑與人血清白蛋白的結合作用,結果表明在37 ℃條件下苯醚甲環(huán)唑與人血清白蛋白結合率高,造成血液中苯醚甲環(huán)唑濃度增大,導致血液中毒。劉永霞等[4]對80只大鼠分組連續(xù)90 d每天經口灌胃染毒苯醚甲環(huán)唑后,動物體重降低,肝及腎組織增大。Mu等[5]將斑馬魚胚胎暴露于苯醚甲環(huán)唑水溶液中,研究了苯醚甲環(huán)唑對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。實驗結果表明,苯醚甲環(huán)唑在斑馬魚胚胎的發(fā)育過程中引起了心率下降、自主運動異常、生長抑制以及多種致畸作用等一系列的不良影響。因此,建立簡單、快速、準確、可靠測定蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留量的檢測方法,對于保護食用者健康具有重要的意義。目前蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留量的檢測方法有氣相色譜(GC)[6],氣相色譜-質譜法(GC-MS)[7-8]和液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[9-10]等。毛久浪等[11]采用氣相色譜電子捕獲器檢測(GC-ECD)毛豆樣品中苯醚甲環(huán)唑的殘留,結果證明苯醚甲環(huán)唑主要殘留在毛豆莢中,去莢可降低毛豆仁苯醚甲環(huán)唑殘留的風險。王遠等[12]建立HPLC-MS檢測蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留的分析方法,結果顯示苯醚甲環(huán)唑質量濃度在0.001～0.5 μg/mL范圍內線性關系良好,檢出限為 0.001 mg/kg。薄海波[13]建立GC-MS法測定水果和蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留的分析方法,檢出限為0.005 mg/kg,方法靈敏度高,選擇性好,抗干擾能力強,適合苯醚甲環(huán)唑殘留量的定性確證分析和定量分析。

多壁碳納米管(MWCNTs)作為一種新型前處理凈化吸附材料,具有機械強度高、表面積大、吸附能力強、耐熱性好和pH適用范圍寬等特點,可有效去除色素和疏水性物質[14],適用于固相萃取[15]、固相微萃取[16]和分散性固相萃取[17]等技術,應用于水質[18]、環(huán)境污染物[19]、農藥殘留[20]和獸藥殘留[21]等的檢測。目前國內外對蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農藥殘留的檢測研究主要集中在氧化鋁[7]、石墨化碳黑[22]和硅酸鎂[23]等方面,對MWCNTs應用于蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農藥殘留檢測的報道較少。因此,本文研究了MWCNTs固相萃取柱對蔬菜基質的凈化效果,以期建立GC-MS法檢測了蔬菜中的苯醚甲環(huán)唑農藥殘留的方法,以達到簡單、快速、準確的檢測苯醚甲環(huán)唑農藥殘留的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水硫酸鎂 分析純,使用前650 ℃下灼燒4 h,備用,天津市凱信化學工業(yè)有限公司;乙酸乙酯 色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;二氯甲烷 色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司;乙腈 色譜純,北京百靈威科技有限公司;丙酮 色譜純,西隴科技股份有限公司;多壁碳納米管(MWCNTs) 直徑20～40 nm,長度:1～2 μm,純度:≥95%,深圳納米港有限公司;氦氣 純度:99.999%,中國科學院蘭州化學物理研究所;丙酮中苯醚甲環(huán)唑溶液標準物質(GBW(E)081913) 濃度為100 μg/mL,北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司;芹菜、番茄、黃瓜、花椰菜、金針菇、韭菜、菠菜、大白菜、茄子和結球甘藍等樣品 每種10個共80批次,隨機購于市場及超市。

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司;KS260控制型圓周振蕩搖床 艾卡儀器設備有限公司;RJ-TDL-60B離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;JJ500電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;固相萃取空管柱 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的提取與凈化 稱取5.00 g蔬菜可食部分粉碎后的樣品于50 mL帶蓋的聚丙烯離心管中,準確加入10 mL乙酸乙酯溶液,再加入適量無水硫酸鎂,振蕩30 min,于3000 r/min離心1 min,用注射器吸取1.0 mL乙酸乙酯上清液待凈化。將10 mg MWCNTs和150 mg無水硫酸鎂用研缽研細,填入固相萃取空管柱。將吸有1.0 mL乙酸乙酯上清液的注射器與MWCNTs凈化柱連接,向下推至進樣瓶,然后向上吸至注射器,再向下推收集于進樣瓶,供GC-MS分析。

1.2.2 萃取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 萃取溶劑的選擇 以黃瓜和結球甘藍為基質添加0.1 μg/mL苯醚甲環(huán)唑標準溶液按照1.2.1步驟處理,考察乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷等不同萃取溶劑對樣品中苯醚甲環(huán)唑回收率的影響。

1.2.2.2 MWCNTs量的優(yōu)化 MWCNTs的用量影響凈化效果和回收率,為了獲得最佳的凈化效果及回收率,按1.2.1過程在黃瓜和樣結球甘藍品中添加濃度為0.1 μg/mL苯醚甲環(huán)唑,分別以5、8、10、12以及15 mg MWCNTs和150 mg無水硫酸鎂填充固相萃取柱,觀察不同用量MWCNTs對乙酸乙酯提取液的凈化效果和比較不同用量MWCNTs對回收率的影響。

1.2.3 標準溶液的配制 準確移取1 mL 100 μg/mL的苯醚甲環(huán)唑標準品溶液至10 mL容量瓶中,用丙酮定容,配成10 μg/mL的標準儲備液,吸取以上標準儲備液適量,并用丙酮稀釋至質量濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL系列標準溶液。

1.2.4 氣相色譜條件 DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度260 ℃;升溫程序:初始溫度70 ℃保持5 min,以25 ℃/min升至150 ℃;以3 ℃/min升至200 ℃,再以8 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;進樣量1.0 μL,不分流進樣。

1.2.5 質譜條件 EI電離源,電離電壓70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;傳輸線溫度280 ℃;溶劑延遲:5 min;選擇監(jiān)測離子:定量離子m/z 323;定性離子m/z 325,325,265,267。

1.2.6 加標回收實驗 采用對陰性樣品進行加標回收實驗來考察方法的準確度和精密度,即對本底不含苯醚甲環(huán)唑的黃瓜、結球甘藍、番茄和韭菜樣品,分別添加相當于0.01、0.10和1.00 μg/mL的苯醚甲環(huán)唑標準溶液,每個添加水平做5個平行樣,連續(xù)重復進樣5次,計算回收率和相對標準偏差。

1.2.7 實樣分析 利用本方法按1.2.1樣品處理步驟對芹菜、番茄、黃瓜、花椰菜、金針菇、韭菜、菠菜、大白菜、茄子和結球甘藍等10種80個代表性蔬菜樣品進行定性定量分析。

1.3 數據處理

萃取溶劑的選擇、加標回收率和實樣分析數據均采用Excel軟件進行計算分析,MWCNTs量的優(yōu)化和線性范圍采用Origin8.5軟件進行計算分析。

2 結果與分析

2.1 萃取溶劑的選擇

對乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷提取苯醚甲環(huán)唑5平行效果進行了比較。由表1可知,回收率在97.3%～99.5%之間,說明以上3種有機溶劑對苯醚甲環(huán)唑的提取具有良好的效率。對于含色素較高結球甘藍樣品經二氯甲烷溶劑提取后,在苯醚甲環(huán)唑出峰位置處或附近有干擾現象。而經乙酸乙酯提取樣品選擇性好,干擾少,且乙腈和二氯甲烷溶劑毒性較強,因此本研究選擇乙酸乙酯溶劑作為提取溶劑。

表1 蔬菜中苯醚甲環(huán)唑在0.1 μg/kg添加水平下的平均回收率及其相對標準偏差(n=5)Table 1 Average recoveries and the RSD of difenoconazole at 0.1 μg/mL spiked in vegetables(n=5)

2.2 MWCNTs量的優(yōu)化

實驗結果顯示,隨MWCNTs用量增加，乙酸乙酯提取液的顏色逐漸變淺,幾乎接近于純乙酸乙酯顏色,說明MWCNTs對于提取液中干擾物具有良好的吸附性,且隨碳納米管量的增加凈化效果越好。

由圖1可知,在結球甘藍和黃瓜基質中苯醚甲環(huán)唑回收率分別為73.5%～96.4%和75.7%～97.9%,呈先增大后降低的趨勢,當MWCNTs的量達到10 mg時回收率最高。綜合凈化效果和回收率,本研究選擇10 mg MWCNTs的量填充固相萃取柱凈化提取液。

圖1 不同MWCNTs米管用量對方法回收率的影響Fig.1 Effects of amount of MWCNTs on method recoveries

2.3 線性范圍和檢出限

取1.2.3配制的苯醚甲環(huán)唑系列標準工作液,在最佳的實驗條件下測定,苯醚甲環(huán)唑的保留時間為9.752 min,苯醚甲環(huán)唑標準溶液的總離子流色譜圖和掃描質譜圖,分別見圖2和圖3。以進樣質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標(如圖4所示),得到標準曲線Y=157086X+922,相關系數r=0.9997,在0.005～2.0 μg/mL范圍內線性關系良好,以3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限為0.001 mg/kg,以10倍信噪比(S/N=10)定量限為0.003 mg/kg,滿足殘留定量分析要求。

圖2 苯醚甲環(huán)唑標準溶液(0.1 μg/mL)的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of difenoconazole standard solution(0.1 μg/mL)

圖3 苯醚甲環(huán)唑標準溶液(0.1 μg/mL)的掃描質譜圖Fig.3 Mass spectrum of difenoconazole standard solution(0.1 μg/mL)

圖4 苯醚甲環(huán)唑標準曲線Fig.4 The standard curve of the difenoconazole

2.4 回收率和精密度

由表2可知,3個添加水平的回收率在84.2%～111.3%的范圍內,相對標準偏差介于5.3%～11.9%之間,表明此方法具有較高的準確度和精密度。因此,實驗中開發(fā)的方法滿足苯醚甲環(huán)唑殘留分析的要求,可用于黃瓜、結球甘藍、番茄和韭菜等樣品中苯醚甲環(huán)唑農藥殘留的檢測。

表2 蔬菜中苯醚甲環(huán)唑在3個添加水平下的平均回收率及其相對標準偏差(n=5)Table 2 Average recoveries and the RSD of difenoconazole at three spiked levels in vegetables(n=5)

2.5 實樣分析

由表3可知,其中番茄、黃瓜和結球甘藍等5個樣品檢出苯醚甲環(huán)唑殘留,其余樣品均未檢出苯醚甲環(huán)唑農藥殘留,對檢出樣品5平行檢測,苯醚甲環(huán)唑含量在0.0407～0.4699 mg/kg之間。根據GB2763-2016[24]檢出樣品均未超過國家食品安全標準要求。

表3 實樣檢測結果Table 3 Sample test results

3 結論

建立了以MWCNTs作為固相萃取柱吸附劑,應用于蔬菜樣品前處理中,聯(lián)合GC-MS檢測蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農藥殘留量的方法,方法的線性范圍為0.005～2.0 μg/mL,相關系數為0.9997,檢出限和定量限分別為0.001和0.003 mg/kg,樣品加標回收率為84.2%～111.3%,應用于實樣檢測,檢出苯醚甲環(huán)唑殘留樣品的RSD介于3.3%～9.9%之間。該方法具有操作步驟簡單、節(jié)省時間、溶劑消耗量少、凈化效果好和檢出限低等優(yōu)點,能夠滿足蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農藥殘留的檢測要求。

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