李玉姬 周煦 裴興華 黃鸝 雷衍軍 張璐璐

[摘要]目的 探討香煙煙霧提取物（CSE）對(duì)小鼠C2C12細(xì)胞肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin）及炎癥介質(zhì)的影響。方法 不同濃度CSE和（或）myostatin-siRNA刺激和（或）干擾小鼠C2C12細(xì)胞后利用MTT檢測(cè)CSE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，根據(jù)處理方式不同，實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組，分別為對(duì)照組、5% CSE組、myostatin-siRNA組、5% CSE+myostatin-siRNA組，采用Real-time PCR檢測(cè)myostatin mRNA表達(dá)情況，采用Western blot檢測(cè)myostatin蛋白表達(dá)情況，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素8（IL-8）含量。結(jié)果 5%以上的CSE處理能顯著抑制小鼠C2C12細(xì)胞增殖（P<0.05）；5%的CSE處理小鼠C2C12細(xì)胞48 h后，myostatin mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-8和TNF-α含量明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；siRNA干擾myostatin后再采用CSE處理小鼠C2C12細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-8和TNF-α含量明顯低于CSE處理組（P<0.05）。結(jié)論 CSE上調(diào)小鼠C2C12細(xì)胞myostatin表達(dá)，增加炎癥介質(zhì)釋放。

[關(guān)鍵詞]慢性阻塞性肺疾??；香煙煙霧提取物；肌肉生長(zhǎng)抑制素；炎癥介質(zhì)

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）2（b）-0004-04

Influence of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells

LI Yu-ji ZHOU Xu PEI Xing-hua HUANG Li LEI Yan-jun ZHANG Lu-lu

The First Department of Critical Care Medicine，Peopel′s Hospital of Hu′nan Province，Changsha 410005，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells.Methods Different concentrations of CSE and/or myostatin-siRNA stimulated or interference mouse C2C12 cells，and then detected influence of CSE on cell growth by MTT，according to the different treatment methods，the experimental research objects were divided into the control group，5% CSE group，the myostatin-siRNA group，5% CSE+myostatin-siRNA group.Real-time PCR was used to detect the expression of myostatin mRNA，Western blot was used to detect expression of myostatin protein，ELISA was used to detected tumor necrosis factor alpha （TNF-alpha） and interleukin 8 （IL-8） level in cell culture medium.Results The CSE at the concentration above 5% could significantly inhibit the proliferation of C2C12 cells in mice （P<0.05）.The expression of myostatin mRNA and protein in C2C12 cells treated with 5% CSE was significantly higher than that of the control group after 48 h （P<0.05）.The content of IL-8 and TNF-alpha in the cell culture fluid was significantly higher than that in the control group （P<0.05）.After siRNA interfered with myostatin，the mouse C2C12 cells were treated with CSE，the content of IL-8 and TNF-alpha in cell culture solution was significantly lower than that in CSE treatment group （P<0.05）.Conclusion CSE can up-regulate the expression of myostatin and increase inflammatory mediators releasing from C2C12 cells.

[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease；Cigarette smoke extract；Myostatin；Inflammatory mediator

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以進(jìn)行性氣流受限為特點(diǎn)的炎癥反應(yīng)性疾病[1]。吸煙是導(dǎo)致COPD發(fā)生的重要因素，香煙煙霧成分能刺激活性氧顯著增加并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[2]。除了肺部異常外，骨骼肌萎縮是最常見的肺外組織改變[3]。前期研究顯示，COPD大鼠肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin）含量顯著增加，能夠促進(jìn)肌肉萎縮，而骨骼肌萎縮的發(fā)生可能與COPD肺部炎癥及全身性炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。筆者推測(cè)香煙煙霧成分升高骨骼肌細(xì)胞myostatin含量，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨骼肌萎縮和功能障礙。本研究采用香煙煙霧處理小鼠C2C12成肌細(xì)胞，觀察myostatin表達(dá)和炎癥反應(yīng)情況，并探討myostatin在骨骼肌炎癥反應(yīng)中的作用，為COPD骨骼肌萎縮的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

小鼠成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫），芙蓉牌香煙（焦油12 mg/支）（湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco），MTT試劑（Sigma），Lipofectamine 3000和TRIzol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR檢測(cè)試劑盒（Takara），BCA蛋白定量試劑盒（WellBiology），ECL發(fā)光液（Pierce），兔抗myostatin多克隆抗體（Proteintech），GAPDH抗體、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒（博士德），myostatin siRNA（GCGGATGGCAAGCCCAAATT，吉瑪生物）。

1.2方法

1.2.1香煙煙霧提取物制備 參照文獻(xiàn)方法并加以改良[5]。將1支芙蓉牌香煙去濾嘴燃燒5 min的煙霧通過注射器連續(xù)抽吸溶于10 ml 37℃預(yù)熱的DMEM中，過濾除菌后作為100%的CSE原液，分別配置1.0%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE工作液，1 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT檢測(cè) 以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，分別給予0.1%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE處理48 h，每組6個(gè)復(fù)孔，依照MTT說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)不同濃度CSE處理后C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.3細(xì)胞干預(yù)和分組 以105個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組，分別為對(duì)照組、5% CSE組、myostatin-siRNA組、5% CSE+myostatin-siRNA組。處理48 h，每組6個(gè)復(fù)孔，收集細(xì)胞上清用于ELISA分析，收集細(xì)胞用于mRNA或蛋白表達(dá)分析。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè) C2C12細(xì)胞按照TRIzol法提取總RNA，依照試劑盒操作逆轉(zhuǎn)成cDNA。使用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增條件為95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCT法[6]計(jì)算各組myostatin的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測(cè) C2C12細(xì)胞按照RIPA裂解法提取總蛋白，BCA試劑盒定量后取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別以myostatin抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶1000）孵育過夜后，二抗（1∶5000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.6 ELISA檢測(cè) C2C12細(xì)胞上清收集后，通過ELISA方法測(cè)定IL-8和TNF-α含量，具體操作步驟依照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較選用最小顯著性差異法（LSD），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度CSE對(duì)小鼠C2C12細(xì)胞增殖的影響

CSE處理小鼠C2C12細(xì)胞48 h，與對(duì)照組吸光值1.21±0.13相比，1.0%和2.5% CSE組平均吸光度值為1.15±0.09和1.11±0.15，無明顯變化，細(xì)胞增殖無明顯影響（P>0.05）；5%和10% CSE平均吸光度均為0.92±0.17，明顯降低，細(xì)胞增殖被明顯抑制（P<0.05）（圖1）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用5% CSE進(jìn)行處理。

2.2各組細(xì)胞myostatin mRNA的表達(dá)水平分析

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，5% CSE組的C2C12細(xì)胞myostatin mRNA表達(dá)水平為1.32±0.15，顯著高于對(duì)照組的1.00（P<0.05）；myostatin-siRNA組的C2C12細(xì)胞myostatin mRNA表達(dá)水平為0.61±0.19，低于對(duì)照組（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA組的C2C12細(xì)胞myostatin mRNA表達(dá)水平為0.92±0.13，低于5% CSE組（P<0.05）（圖2）。

2.3各組細(xì)胞myostatin 蛋白的表達(dá)水平分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，5% CSE組的C2C12細(xì)胞myostatin蛋白表達(dá)水平為1.40±0.11，顯著高于對(duì)照組的1.00（P<0.05），myostatin-siRNA組的C2C12細(xì)胞myostatin蛋白表達(dá)水平為0.52±0.17，低于對(duì)照組（P<0.05），5% CSE+myostatin-siRNA組的C2C12細(xì)胞myostatin蛋白表達(dá)水平為0.93±0.15，低于5% CSE組（P<0.05）（圖3）。

2.4各組細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，5% CSE組C2C12細(xì)胞上清中的IL-8和TNF-α含量分別為835.83±47.30和218.83±27.09，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；myostatin-siRNA組C2C12細(xì)胞上清中的IL-8和TNF-α含量分別為510.17±49.15和110.67±12.60，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA組C2C12細(xì)胞上清中的IL-8和TNF-α含量分別為709.83±111.75與162.17±23.52，低于5% CSE組（P<0.05）（圖4）。

3討論

目前，COPD已經(jīng)成為全球第四大致死性疾病，每年受COPD困擾的患者多達(dá)6億。全球30歲以上人群中，COPD的患病率從1990年的10.7%上升到2010年的11.7%[7]。2013年全球疾病負(fù)擔(dān)（GBD 2013）報(bào)告指出，COPD導(dǎo)致的死亡人數(shù)從1990年的242.13萬上升至2013年的293.12萬，約占全球死亡人數(shù)的6%，成為全球第三大致死性疾病[8]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，COPD是增長(zhǎng)最為迅速的死因之一，在心腦血管疾病病死率大幅下降的同時(shí)，COPD的死亡率卻增加了163%[9]。隨著發(fā)展中國(guó)家吸煙率的增加和高收入國(guó)家的老齡化，COPD的發(fā)病率預(yù)計(jì)在未來30年內(nèi)將上升，預(yù)計(jì)到2030年將有超過450萬人死于COPD和相關(guān)疾病，死亡人數(shù)將接近全球死亡總數(shù)的8.5%，成為全球第3位死因疾病。近年來，我國(guó)COPD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2015年）》指出，我國(guó)40歲及以上人群中COPD患病率為9.9%。張榮葆等[10]針對(duì)中國(guó)已發(fā)表的19項(xiàng)COPD大型流行病學(xué)調(diào)查資料（2000年1月～2011年12月）分析后，發(fā)現(xiàn)中國(guó)各地40歲以上人群COPD患病率為6.0%～15.4%。

吸煙是COPD發(fā)生、發(fā)展過程中最重要的危險(xiǎn)因素，香煙煙霧成分能導(dǎo)致肺部乃至全身異常的炎癥反應(yīng)，引起肺癌組織如骨骼肌、心血管等病變，加重COPD的進(jìn)展[11]。骨骼肌是COPD受累最主要的肺外組織，研究顯示，吸煙能導(dǎo)致蛋白合成減少和降解增多，從而導(dǎo)致骨骼肌消耗[12]。此外，香煙煙霧成分能使肺部產(chǎn)生過多的炎癥介質(zhì)（如IL-8和TNF-α）并釋放到循環(huán)中，參與骨骼肌萎縮的發(fā)生[13]。在骨骼肌的消耗及功能障礙過程中，肌肉生長(zhǎng)抑制素受到廣泛關(guān)注，其主要作用為抑制肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，在肌肉消耗性疾病中表達(dá)增高[14]。前期研究已證實(shí)，COPD大鼠myostatin含量顯著增加，而其在骨骼肌炎癥中的作用如何尚未查見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，CSE處理小鼠成肌細(xì)胞C2C12后細(xì)胞myostatin表達(dá)增加，炎癥介質(zhì)釋放增多；而用myostatin-siRNA沉默myostatin基因后再用CSE處理細(xì)胞，myostatin表達(dá)增加程度受到抑制，炎癥介質(zhì)釋放減少。這提示CSE處理能誘導(dǎo)myostatin表達(dá)，沉默myostatin基因后，CSE促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放的作用受到限制，而單純的myostatin基因沉默并不影響細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放，提示myostatin并不直接參與炎癥反應(yīng)的上游調(diào)控，而在CSE刺激后，抑制myostatin能夠反饋性的減少CSE所致的炎癥反應(yīng)，因此，CSE可導(dǎo)致myostatin水平升高，骨骼肌消耗和萎縮，炎癥反應(yīng)加重，與COPD呈正相關(guān)。myostatin沉默后，骨骼肌消耗和萎縮減少，能夠?qū)笴SE所致的炎癥反應(yīng)，緩解COPD[15]。香煙煙霧成分誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生后，可以通過促進(jìn)蛋白分解和抑制蛋白合成來誘導(dǎo)骨骼肌消耗[16]，同時(shí)活化p38和ERK的MAPK信號(hào)，應(yīng)用p38和ERK的抑制劑能夠消除肌肉萎縮和肌球蛋白降解[17]，而吸煙者肌肉蛋白合成降低主要與myostatin表達(dá)增加有關(guān)，myostatin通過抑制Akt的活化，阻礙蛋白合成的啟動(dòng)和細(xì)胞更新而抑制肌肉生長(zhǎng)[18]，同時(shí)香煙煙霧成分能減低肌肉中活化的Akt，并損害肌肉細(xì)胞的分化能力[19]。早期研究顯示，COPD患者的運(yùn)動(dòng)功能受限主要?dú)w因于其肺功能受損，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多肺功能受損不明顯的患者也存在運(yùn)動(dòng)功能異常[20]，而干預(yù)myostatin來改善骨骼肌功能障礙對(duì)于更好地防治COPD炎癥反應(yīng)和疾病演變，改善預(yù)后，提高生活質(zhì)量可能有著重要的價(jià)值。

綜上所述，通過小鼠C2C12成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，觀察香煙煙霧提取物對(duì)myostatin表達(dá)和炎癥反應(yīng)的影響，并通過沉默myostatin表達(dá)觀察炎癥反應(yīng)的改變，并將myostatin作為研究重點(diǎn)，為COPD骨骼肌萎縮和炎癥反應(yīng)的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-29 本文編輯：祁海文）