劉 雪,王靜楠,陳文學,陳榮豪,張觀飛

(海南大學食品學院,海南?？?570228)

檸檬烯,又稱苧烯,學名為 1-甲基-4-異丙基環(huán)己烯,分子式為C10H16,是一種環(huán)己酮單萜,常溫下是一種無色油狀液體[1-2]。天然檸檬烯存在3種異構體形式,包括D、L和DL構型,其中最常見的是D-檸檬烯[3]。由于其透明度和令人愉快的柑橘香味,檸檬烯在食品和飲料行業(yè)通常被用作添加劑[4]。在國外,美國食用香料與提取物制造商協(xié)會認定其毒性屬于GRAS(一般公認安全)級,FAO和WHO對D-檸檬烯的ADI(每日容許攝入量)也不進行特殊規(guī)定[5-6]。在國內,GB2760-2011食品添加劑使用標準中規(guī)定D-檸檬烯為允許使用的香料[3]。

檸檬烯是很多植物油如檸檬油、柑橘油、橙皮油等的主要成分,在胡椒油中含量也比較豐富[2]。徐可文等通過氣相色譜-質譜法(GC-MS)測得黑胡椒揮發(fā)油中D-檸檬烯的含量在12.32%～20.35%之間,也有研究表明胡椒提取物中含有萜烯類物質,包括檸檬烯[7-8]。目前,國內外研究表明檸檬烯具有抑菌作用。LIS-BALCHIN等人[9]研究了(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯在體外對25種不同的革蘭氏菌以及20種單核細胞增生李斯特菌的抗菌活性,結果表明二者都具有抑菌性。SINGH等[10-11]發(fā)現(xiàn)檸檬烯對青霉、綠霉和黃曲霉均具有較好的抑制性。王雪梅等人[12]的研究表明檸檬烯具有廣譜抗菌性。

近年來,由食源性致病菌引起的食源性疾病頻發(fā),對整個社會的食品安全和公共安全造成了重大威脅[13]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),又稱綠膿桿菌,是一種食源性致病菌,也是常見的條件致病菌,會引起食源性疾病包括食物中毒、腸道傳染病等[14]。研究表明,檸檬烯對銅綠假單胞菌存在抑菌效果[15],然而關于檸檬烯對銅綠假單胞菌的抑菌機理尚未見有報道。本研究通過測定檸檬烯的最小抑菌濃度(MIC)及細菌生長曲線等指標,探討檸檬烯的抑菌活性,進一步揭示檸檬烯對銅綠假單胞菌的抑菌機理,為檸檬烯應用于食品的保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(+)-檸檬烯(>95.0%) 日本東京化成工業(yè)株式會社(TCI);銅綠假單胞菌(ATCC 9027) 廣東省微生物菌種保藏中心;牛肉膏、瓊脂、蛋白胨、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS) 北京索萊寶科技有限公司;氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 廣州化學試劑廠;羅丹明123 上海源葉生物科技有限公司。

高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;無菌超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;SPX生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;SHA-2恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;F-280熒光分光光度計 天津港東科技發(fā)展股份有限公司;艾本德 5804R臺式高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;DDS-307電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司;S-3000掃描式電子顯微鏡 日本日立公司;電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將銅綠假單胞菌在營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基中傳代活化后保存?zhèn)溆?采用麥氏比濁法[16],將銅綠假單胞菌置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,用生理鹽水(0.9% NaCl)將培養(yǎng)后的細菌從斜面上洗脫下來,并將菌懸液的濃度稀釋至含菌量約為106～107cfu/mL。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用肉湯稀釋法[17],根據(jù)黃聰亮、潘旭遲[18-19]的方法做適當調整,用70%乙醇溶解檸檬烯,并將其二倍梯度稀釋成200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mL/L的抑制液,在平板中加入上述配制好的2 mL抑制液,與18 mL降溫至50 ℃左右的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基混合均勻,使其終濃度分別為20.0000、10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125 mL/L。待培養(yǎng)基凝固后取0.2 mL濃度約為107cfu/mL的供試菌懸液于平板上涂布均勻。以無菌水和70%乙醇作為空白對照和陰性對照,每個濃度設置3個平行,將各平板于37 ℃中倒置培養(yǎng)24 h。觀察,以完全不長菌的最小稀釋濃度確定為檸檬烯對銅綠假單胞菌作用的MIC。

1.2.3 細菌生長的測定 采用干重法,使用無菌生理鹽水(0.9%)將銅綠假單胞菌梯度稀釋至106～107cfu/mL,將菌懸液按照1%(v/v)的接種量接種到液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h后,加入檸檬烯使其終濃度為1 MIC、2 MIC,每隔1 h取樣,先置于預先烘干并稱重的離心管中8000 r/min離心,棄上層菌液,然后用無菌水重懸洗滌,將菌體置于80 ℃下烘干至恒重后,測得菌體干重。以無菌水作為對照組。

1.2.4 掃描電鏡(SEM) 根據(jù)Diao Wen-Rui等人[20]的方法做適當調整,對所測試的細菌進行SEM觀察。供試菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,分別加入1 MIC和2 MIC濃度的檸檬烯,以無菌水和70%乙醇作為空白對照和陰性對照,將各組菌懸液37 ℃搖床培養(yǎng),取培養(yǎng)4、16 h的菌懸液,6000 r/min離心10 min收集菌體。先用0.1 mol/L PBS洗滌3次,再分別用濃度為20%、40%、60%、80%乙醇溶液進行梯度脫水,每個濃度洗脫2次,最后用無水乙醇洗脫3次。將脫水后的樣品在-20 ℃條件下預凍,再使用真空冷凍干燥器冷凍干燥12 h。取出干燥完全的樣品、上樣、通過陰極噴涂將樣品金覆蓋,在掃描電子顯微鏡上觀察供試菌放大8000倍的細胞形態(tài)。

1.2.5 菌液電導率的測定 根據(jù)張新虎[21]等的方法做適當調整,將生長到對數(shù)期的銅綠假單胞菌用無菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)洗滌3次,取菌液與檸檬烯溶液混合,使其終濃度為1 MIC、2 MIC,用70%乙醇替代檸檬烯溶液作為對照組,每隔10 min測定1次電導率,連續(xù)2 h。

1.2.6 膜電位的測定 根據(jù)Zhang Yunbin[22]的方法做適當調整,采用羅丹明123熒光染色法測定膜電位。供試菌在液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h,調整菌液濃度約為106～107cfu/mL。分別加入1 MIC和2 MIC濃度的檸檬烯,以無菌水和70%乙醇作為空白對照和陰性對照,150 r/min振搖培養(yǎng)3 h后離心棄上清再用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗2次。將羅丹明123用無菌磷酸鹽緩沖液溶解,配制成濃度為1 mg/mL的母液,加入菌液中使其終濃度為2 μg/mL,避光孵育30 min。菌液用無菌磷酸鹽緩沖液充分洗凈、重懸。轉移到石英比色皿中,用熒光分光光度計測定平均熒光強度。激發(fā)波長為480 nm,發(fā)射波長為530 nm,狹縫寬度為10 nm,該數(shù)據(jù)用平均熒光強度表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用DPS的單因素方差分析進行差異性分析(p<0.05),并使用Origin 9.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 檸檬烯的最小抑菌濃度

最小抑菌濃度(MIC)是衡量物質抑菌能力的標準之一[23]。檸檬烯對銅綠假單胞菌的MIC見表1。

表1 檸檬烯的最小抑菌濃度(MIC)Table 1 MIC of limonene on bacteria

表1可知,檸檬烯對銅綠假單胞菌存在較強的抑菌作用,MIC為10 mL/L,而且隨著檸檬烯濃度的提高,其抑菌能力也在增強。同時,無菌水和乙醇組均有菌生長,說明其不能對銅綠假單胞菌產生抑制作用。潘旭遲[19]等研究發(fā)現(xiàn)檸檬烯作為檸檬油的有效抑菌成分,其標準品對金黃色葡萄球菌的MIC為6.25 μg/mL,抑制作用較強。

2.2 檸檬烯對銅綠假單胞菌生長的影響

微生物生長曲線是反映微生物數(shù)量(活細菌個數(shù)或細菌重量)隨培養(yǎng)時間變化的曲線,測定方法包括比濁法、干重法、血球板計數(shù)法和平板菌落計數(shù)法[24]。檸檬烯對銅綠假單胞菌生長的影響見圖1。

圖1 檸檬烯對銅綠假單胞菌生長的影響Fig.1 Effect of limonene on the growth of P. aeruginosa

由圖1可見,對照組的菌體干重隨著培養(yǎng)時間增加不斷提高,在前11 h里持續(xù)上升至1.0,細菌不斷增殖,生長速度快,11～12 h期間保持穩(wěn)定,可能是細菌生長已達到穩(wěn)定期,新增殖的細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等,新細胞使干重增加,而老細胞死亡后發(fā)生自溶減少干重,所以干重保持相對穩(wěn)定。對于實驗組,當銅綠假單胞菌經(jīng)過1 MIC和 2 MIC檸檬烯處理后,其生長曲線發(fā)生明顯變化,菌體干重隨著培養(yǎng)時間的延長圍繞0.2上下波動,在8 h后逐漸平穩(wěn)并在11 h發(fā)生下降,并且均顯著低于對照組(p<0.05)。2 MIC組與1 MIC組相比,前者的菌體干重小于后者,說明檸檬烯濃度的提高會使銅綠假單胞菌生長受到更強的抑制,即抑制程度2 MIC>1 MIC。實驗表明,檸檬烯能夠顯著抑制銅綠假單胞菌的正常生長,抑制其細胞增殖速度,從而發(fā)揮抑菌作用。

2.3 銅綠假單胞菌的掃描電鏡

為了進一步確認檸檬烯對銅綠假單胞菌的抑菌作用方式,進行掃描電鏡分析[25],見圖2。

圖2 銅綠假單胞菌的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microphotographs of P. aeruginosa注:A1、B1、C1、D1:4 h處理后的空白組、對照組、1MIC組、2MIC組;A2、B2、C2、D2:16 h處理后的空白組、對照組、1MIC組、2MIC組。

通過圖中A1、A2能夠看出,不添加抑菌物質的銅綠假單胞菌菌體外表光滑,呈桿狀分布,結構規(guī)則完整,無褶皺變形。如圖B1、B2所示,添加乙醇的陰性對照組處理4 h后,供試菌形態(tài)無明顯變化,處理16 h后,部分菌體發(fā)生凹陷。根據(jù)圖C1、D1,添加1 MIC和2 MIC的檸檬烯作用4 h后,銅綠假單胞菌小部分出現(xiàn)空洞干癟,同時有細胞堆疊、粘結。作用16 h后,由圖C2、D2所示,菌體變化明顯,細胞形態(tài)已遭到嚴重破壞,絕大部分菌體發(fā)生萎陷,出現(xiàn)空洞,表面粗糙不平整,同時部分菌體變短,有細胞斷裂現(xiàn)象,難以發(fā)現(xiàn)形態(tài)正常的菌體。而且,添加2 MIC檸檬烯的菌體與1 MIC相比受破壞程度更嚴重,斷裂和存在孔洞的菌體更多。說明檸檬烯可以抑制銅綠假單胞菌的生長,改變細胞原有的正常形態(tài),破壞細胞壁和細胞膜,最終導致其死亡。Di Pasqua等[26]人通過掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌和假單胞菌屬菌株經(jīng)檸檬烯作用后,細胞膜結構發(fā)生明顯改變,菌體出現(xiàn)粘結、腫脹,甚至裂解,與本實驗結果相類似。

2.4 檸檬烯對銅綠假單胞菌電導率的影響

在細菌受到強抑菌物質的作用時,菌體的細胞膜遭到破壞,失去原有保護能力,細胞內有帶電離子等溶出,內部電解質向外泄露到培養(yǎng)液中,導致培養(yǎng)液的電導率增加。因此,細菌細胞膜通透性的變化可以通過菌液電導率值的變化來反映[27]。

由圖3可知,對照組的電導率在前40 min內持續(xù)增加,40～110 min時相對平穩(wěn),可能是因為細胞的正常裂解和死亡,導致其電導率上升。當檸檬烯濃度為1 MIC和2 MIC時,隨著時間的增加,銅綠假單胞菌菌液的電導率均高于對照組,同時,其電導率總體呈上升趨勢。這意味著細胞膜的滲透性增加,導致細胞內成分的滲漏,特別是電解質的損失,包括K+、Ca2+、Na+。對實驗組來說,添加1 MIC和2 MIC的菌液電導率曲線在時間變化過程中出現(xiàn)交叉、重合,二者的電導率值在大部分時間點不存在顯著差異(p>0.05),原因可能是達到1 MIC濃度的檸檬烯已經(jīng)對細胞膜進行了充分的破壞,使電解質大量外滲,2 MIC從數(shù)值上在前期略有增加但無顯著差異。結果表明,檸檬烯能夠提高銅綠假單胞菌細胞膜的通透性,破壞細胞內部穩(wěn)定性,從而發(fā)揮抑菌作用。王亞麗[28]等的研究也顯示,藍莓葉多酚能夠增加銅綠假單胞菌細胞膜的通透性,反映出抑菌性。

圖3 檸檬烯對銅綠假單胞菌電導率的影響Fig.3 Changes in electric conductivity of broth for P. aeruginosa by limonene

2.5 檸檬烯對銅綠假單胞菌膜電位的影響

檸檬烯對銅綠假單胞菌膜電位的影響如圖4所示,未添加檸檬烯的菌液中銅綠假單胞菌的平均熒光強度為386.38 AU,當添加1 MIC、2 MIC濃度的檸檬烯后,銅綠假單胞菌的平均熒光強度分別為140.23 AU和11.50 AU,與對照組相比分別降低了63.73%和97.02%,二者與對照組相比,均存在極顯著差異(p<0.01)。同時2 MIC組在1 MIC組的基礎上下降了91.80%,表明檸檬烯濃度的增加會使銅綠假單胞菌的平均熒光強度顯著降低(p<0.01)。

圖4 檸檬烯對銅綠假單胞菌膜電位的影響Fig.4 Effect of limonene on the membrane potential(MP)of P. aeruginosa

膜電位是指生物細胞膜內部和外部之間存在的電勢差,典型的例子是線粒體膜電位,維持正常的線粒體膜電位是保持線粒體氧化磷酸化水平和產生ATP以維持細胞功能的前提[29]。羅丹明123是一種親脂性陽離子染料,憑借跨膜電位進入到細胞基質中,其熒光強度的大小可反映膜電位的變化[30]。對于正常的細菌來說,通常膜內的電壓比膜外的低。如果膜電位降低,則說明細胞發(fā)生了去極化現(xiàn)象,反之,如果升高說明發(fā)生了超極化現(xiàn)象[31]。本實驗表明,檸檬烯的添加導致銅綠假單胞菌膜電位降低,引起了細胞的去極化,影響細胞的正常代謝活動,進而抑制其生長,導致細菌死亡。

3 結論

本研究通過測定最小抑菌濃度(MIC)評估了檸檬烯的抑菌活性,通過測定細菌生長曲線、掃描電鏡觀察形態(tài)、測定細胞膜通透性以及膜電位揭示了檸檬烯對銅綠假單胞菌的抑菌機理。結果表明:檸檬烯對銅綠假單胞菌具有抑制作用,抑菌活性較強;檸檬烯抑制了銅綠假單胞菌的生長,其細胞膜原有完整結構遭到破壞;在檸檬烯作用下,銅綠假單胞菌細胞膜通透性增大,內部電解質溶出,菌液的電導率不斷增加;細胞膜電位降低,熒光喪失,細胞發(fā)生去極化導致不規(guī)則的細胞代謝活動,引發(fā)銅綠假單胞菌走向死亡。檸檬烯是許多精油的主要組成部分,尤其是黑胡椒油的主要活性成分,本研究初步探究檸檬烯對銅綠假單胞菌的抑菌機理,也為胡椒中檸檬烯和其他活性成分進一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

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