吳 星，張 艷，雍 斌，李 州，彭 燕

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，成都 611130)

TrFQR1屬于依賴FMN的還原酶超家族，是一個以FMN為輔基且依賴于NADPH的醌氧化還原酶家族蛋白[FMN-dependent NADPH quinone reductase family (FMN_red)][1]。FMN(flavin mononucleotide)是黃素蛋白的輔基，參與氧化還原反應、催化脫氫、氧化和電子轉移或羥基化過程，在呼吸等生物氧化過程的電子傳遞中具有重要作用[2]。醌作為一種自然界中廣泛存在的有毒物質(zhì)，能誘發(fā)哺乳動物細胞癌變和壞死[3]。醌氧化還原酶能減少醌類轉化可能引起的細胞器及遺傳物質(zhì)損傷，保證機體的正常生理功能，因而受到廣泛關注[4]。已有證據(jù)表明，該類基因及其產(chǎn)物與多種疾病的發(fā)生關系密切，具有對醌類物質(zhì)的解毒作用[5-7]。李莉等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，NQO1的表達水平與卵巢癌預后并無明顯相關性，而NQO2表達水平越高，卵巢癌臨床預后越好；王艷等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)NQO1表達量增高能減少多巴胺引起的細胞內(nèi)醌化蛋白含量，從而減輕多巴胺對細胞產(chǎn)生的毒性作用；陳浩等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/NQO1通路可以調(diào)節(jié)胃黏膜組織中SOD和 MDA的活性，增強細胞對氧化應激的耐受性，發(fā)揮保護細胞的作用；張大生[11]的研究發(fā)現(xiàn)，NQO1參與了血根堿的還原反應，NQO1過表達降低了血根堿誘導的細胞毒性，起保護細胞的作用；還有許多研究表明，大腸桿菌中 WrbA 受脅迫響應 SIGMA 因子RpoS 控制，在受到酸、鹽和過氧化氫等脅迫下表達量增加[12-16]。

白三葉(Trifoliumrepens)是一種世界性分布與栽培的多年生豆科飼草，由于具有蛋白質(zhì)含量高、再生速度快以及良好的固氮能力等特點，在改良天然草地和建植人工混播草地過程中發(fā)揮著巨大作用[17-18]。然而，白三葉屬淺根型作物，喜冷涼濕潤氣候，抗旱耐鹽性等[19-20]抗逆性較差。干旱、鹽堿等非生物脅迫常導致白三葉細胞內(nèi)活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量增加，引起膜系統(tǒng)氧化損傷，最終導致細胞死亡[21-24]。在白三葉抗逆機制的研究中，清除ROS、MDA等物質(zhì)能夠顯著提高白三葉的抗逆性[18]。

綜上所述，醌氧化還原酶的研究大多集中于與細菌和人類相關的研究中，并且常作為一種還原劑，參與氧化還原反應，保護細胞免受毒害。而在白三葉中，TrFQR1是否能減輕細胞氧化傷害，響應非生物脅迫，提高抗逆性，仍未見報道。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

以‘拉丁諾’白三葉為供試材料，采用石英砂基質(zhì)培養(yǎng)。選取籽粒飽滿、大小一致的白三葉種子，經(jīng)0.1% NaClO消毒后，均勻播種在裝有石英砂的白色育苗盤(長35 cm，寬25 cm，高10 cm)，24 ℃光照培養(yǎng)箱中(光強2 000 lx)進行發(fā)芽，待發(fā)芽7 d后，用Hoagland全營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，溫度為白天23 ℃，夜晚19 ℃，時長均為12 h，相對濕度為75%，光強250 μmol·m-2·s-1，每2 d更換1次營養(yǎng)液，全營養(yǎng)液培養(yǎng)30 d后用于試驗。分別用15% PEG6000、200 mmol/L NaCl、4 ℃低溫、600 μmol/L CdSO4、25 μmol/L SNP、0.02 mmol/L NaHS、10 mmol/L H2O2和5 mmol/L CaCl2溶液，對30 d的白三葉幼苗全株進行處理，處理時間為0、1.5、3、6、12和24 h。每處理每個時間點處理15株，處理完相應時間后，隨機分成3份，每份5株進行取樣編號(取成熟的第2葉)。取樣后立即用液氮冷凍，提取各處理的總RNA用于cDNA的合成，其中15% PEG處理3 h的樣品也用于制備5/3-RACE-ready cDNA，RNA保存在-80 ℃冰箱。

PCR反應體系中的高保真酶用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(寶生物公司提供)，白三葉RNA提取參照捷倍斯公司試劑盒(Plant RNA Kit)說明書，5/3-RACE-ready cDNA 用寶生物公司試劑盒合成(SMARTerTM)，提取的總RNA參照美國Bio-Rad Laboratories公司反轉錄試劑盒(iScriptTMcDNA Synthesis Kit)說明書進行反轉錄獲得cDNA第一鏈。內(nèi)參引物為實驗室篩選的肌動蛋白基因(β-Actin)特異引物。實時熒光定量PCR參照寶生物公司試劑盒(SYBR Premix Ex Taq II)說明書，所用儀器為ABI的7500fast設備。

1.2 方 法

1.2.1白三葉TrFQR1基因克隆用已測轉錄組中FQR1的mRNA序列去NCBI數(shù)據(jù)庫上比對同源基因的閱讀框，在靠近起始密碼子和終止密碼子且同源性高的區(qū)域設計跑5′-RACE(5′-CAGCCTCAGCGAGTTCATCTGGGGT-3′) 和3′-RACE的引物(5′-AAGGCGGTGGACAAGAGACTACAGCG-3′)，再用已制備的5′/3′-RACE-ready cDNA為模板，分別進行擴增。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行電泳檢測(1%)；參照天根生物普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說明書對目的片段進行回收；采用pMD-19T載體連接回收產(chǎn)物；連接成功后轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞并培養(yǎng)10～12 h。然后進行藍白斑檢測篩選，挑選白斑進行菌液培養(yǎng)，然后經(jīng)PCR檢測選取5個陽性菌落送華大基因(北京)股份有限公司進行測序。

根據(jù)上述試驗獲得的序列設計閱讀框的引物，即ORF-F(5′-ATGGCTGTCAAACTTTACATTGTAT-3′)和 ORF-R(5′-ATTATGCAGCTTCCTTGAGCTTCTT-3′)，再用15% PEG處理3 h的‘拉丁諾’白三葉葉片cDNA為模板進行擴增。RT-PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。得到的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，切膠回收，連接載體，轉化大腸桿菌，涂板篩選，挑菌檢測，測序,具體步驟同上。

將2次測序得到的序列去掉載體序列，再用DNAMAN 軟件進行拼接，獲得白三葉TrFQR1 cDNA全長。

1.2.2TrFQR1生物信息學分析利用DNAMAN 軟件找到TrFQR的 ORF，并進行蛋白翻譯預覽，找出其編碼的氨基酸序列。用Protparam工具進行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析。氨基酸疏水性分析采用Protscale?？缒そY構預測采用TMHMM軟件。利用SignalP4.1 Server預測蛋白信號肽。利用SOPMA工具預測蛋白質(zhì)二級結構。利用Swiss-Model軟件進行蛋白質(zhì)三級結構分析。采用NetPhos 3.1 Server預測磷酸化位點。用FoldIndex 進行無序化特征預測。

利用Blast程序軟件，從GenBank中再挑選8個來源于豆科(蝶形花科)植物的依賴FMN的還原酶超家族基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列，利用ClustalX 2軟件進行氨基酸多序列比對分析，并用Mega5.1 軟件基于鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3白三葉TrFQR1的表達模式依據(jù)引物設計原則設計‘拉丁諾’白三葉TrFQR1定量表達引物qPCR-F (5′-CTCCTTCCATACTGGTCTCCTCCGC-3′) 和qPCR-R (5′-GCCCAAACATTAGGTGGTCTT-3′)。以不同處理及不同處理時間的‘拉丁諾’白三葉葉片cDNA為模板，以β-actin (Act-F：5′-TTACAATGAATTGCGTGTTG-3′和Act-R：5′-AGAGGACAGCCTGAATGG-3′)作為內(nèi)參，分別對其進行實時熒光定量。實時熒光定量PCR參考SYBR?Premix Ex TaqTMI (TliRNase H Plus)試劑盒說明書(大連TaKaRa公司), 采用兩步法。擴增程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。用96孔上樣板，目的基因與內(nèi)參基因對應，操作時避免強光照射。設3次重復。采用2-ΔΔCt方法[25]計算相對表達量。采用Excel2003進行繪圖與數(shù)據(jù)處理；SAS8.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 白三葉TrFQR1基因克隆

用 DNAMAN6.0軟件分析試驗得到的白三葉TrFQR1 cDNA，其長為1 003 bp。設計引物ORF-F、ORF-R克隆白三葉TrFQR1的編碼區(qū)，純化回收目的片段，連接pMD-19T載體后轉化大腸桿菌, 利用菌液PCR篩選陽性克隆, 得到1條612 bp的目的片段(圖1)，說明克隆TrFQR1基因已插入載體中。對挑選的陽性克隆進行測序得到堿基序列，測序結果(圖 2)與預測結果一致。

2.2 TrFQR1結構和理化特性預測

通過DNAMAN6.0軟件對TrFQR1進行翻譯，發(fā)現(xiàn)其編碼203個氨基酸。通過ProParam工具預測該蛋白分子式為C993H1529N251O290S8，分子量(MW)為21.88 kD，等電點理論為5.96，帶有負電殘基( Asp + Glu) 21個，帶有正電氨基酸殘基(Arg +Lys) 18個，肽鏈中Gly含量最多，共26個，占總量的12.8%； 其次是Ala，共23個，占11.3%。不穩(wěn)定指數(shù)為32.77，低于40的閾值，預測此蛋白較穩(wěn)定。總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity, GRAVY)為-0.116，表明該蛋白為親水性蛋白(圖3，A)。用Signal P4程序預測TrFQR1不含信號肽，因此不屬于分泌蛋白(圖3，B)。用TMHMM軟件預測TrFQR1無跨膜結構(圖3，C)。TrFQR1蛋白進行固有無序化分析的結果顯示，TrFQR1蛋白沒有無序化特征，預測該蛋白有較強的剛性結構，行使功能時其構象不會發(fā)生改變(圖3，D)。磷酸化位點預測發(fā)現(xiàn)TrFQR1的11、29、53、58、118、162、178位氨基酸為絲氨酸(Ser) 磷酸化位點，13、114位為絡氨酸(Tyr) 磷酸化位點，43、64、102、116、126、168、194、196位為蘇氨酸(Thr) 磷酸化位點(圖3，E)。用ExPASy-PROSITE預測發(fā)現(xiàn)TrFQR1具有Flavodoxin-like結構域，在 N 端 11～15 位氨基酸和 C 端112～165位氨基酸是 FMN 結合區(qū)域(圖2)。用 SOPMA 工具分析氨基酸序列二級結構(圖3，F(xiàn)) 表明，該蛋白中，α螺旋(α helix)有 100個氨基酸，占總量的 49.26%；無規(guī)則卷曲(random coil)有 54個氨基酸，占26.6%；延伸鏈(extended strand)和β轉角(β turn)各29和20個，分別占14.29%和9.85%。三級結構預測結果如圖 3，G。

M.DL2000；1. TrFQR1 編碼區(qū)PCR產(chǎn)物圖1 TrFQR1 編碼區(qū)電泳產(chǎn)物M. DL2000; 1. PCR product of TrFQR1 coding sequenceFig.1 Electrophoresis results of TrFQR1 coding sequence

ATG. 起始密碼子； TAA. 終止密碼子；橫線標出FMN 結合位點。圖2 TrFQR cDNA 全長及其編碼氨基酸序列ATG. Start codon； TAA. Start codon；Horizontal line. FMN binding siteFig.2 Nucleotide sequences and deduced sequence of amino acid residues of TrFQR

2.3 多重序列比對及系統(tǒng)進化發(fā)育樹

將TrFQR1 cDNA 序列推導編碼的氨基酸序列在NCBI 在線數(shù)據(jù)庫進行 Blast，找到與TrFQR1一致性較高的同源蛋白有蒺藜苜蓿(XP_003596543.1)、鷹嘴豆(XP_004487638.1)和狹葉羽扇豆 (XP_019437051.1)等。 將白三葉TrFQR1氨基酸序列與其他 8個物種同源蛋白多序列比對，氨基酸序列相似度達到94.96%，而白三葉‘拉丁諾’TrFQR1與蒺藜苜蓿的相似度最高，為95.57%(圖5) ，系統(tǒng)發(fā)育樹結果也表明，白三葉‘拉丁諾’與蒺藜苜蓿遺傳距離比較接近(圖4)。

2.4 各處理下白三葉TrFQR1基因表達量的變化

由圖6可看出，在PEG脅迫下，白三葉的TrFQR1基因的表達量在處理3 h時顯著升高且達到最大值，為對照組的8.58倍；在NaCl處理下，白三葉TrFQR1基因的表達量持續(xù)升高；在低溫處理中，白三葉TrFQR1基因的表達量在6 h時顯著降低且達到最小值，為對照組的0.34倍；在CdSO4處理下，白三葉TrFQR1基因的表達量隨著處理時間的增加而增加；在SNP處理中，白三葉TrFQR1基因的表達量在1.5 h時顯著升高且達到最大值，為對照組的3.61倍；在NaHS處理中，白三葉TrFQR1基因的表達量在1.5 h時顯著降低且達到最小值，為對照組的0.49倍；在H2O2處理中，白三葉TrFQR1基因的表達量在1.5 h顯著升高，在6 h達到最大值，為對照組的8.43倍；在CaCl2處理中，白三葉TrFQR1基因的表達量在1.5 h時顯著升高且達到最大值，為對照組的2倍。

A． 用ProtScale程序預測蛋白質(zhì)疏水性; B. 用Signal P4程序預測信號肽; C. 用TMpred程序預測跨膜區(qū)段; D.FoldIndex預測蛋白無序化特征; E. NetPhos 3.1 Server預測磷酸化位點; F. 二級結構預測; G. 三級結構預測圖3 白三葉‘拉丁諾’TrFQR1蛋白生物信息學分析A. Predicted protein hydrophobicity by ProtScale; B. Predicted signal peptide by Signal P4; C. Transmembrane helical segments predicted by TMpred; D. Predication of disordered proteins by FoldIndex; E. Predicted phosphorylation sites by NetPhos 3.1 Server; F. Predicted secondary structure; G. Predicted 3-D structureFig.3 Bioinformatic analysis of TrFQR1 protein in Trifolium repens cv. ‘Ladino’

圖4 FQR1系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of FQR1

圖5 FQR1蛋白多序列比對Fig.5 Multiple protein sequence alignment result of FQR1

小寫字母表示同一處理不同處理時間0.05水平差異顯著圖6 各處理下白三葉 ‘拉丁諾’ 葉片TrFQR1基因的相對表達量The normal letters mean significant difference amang the same treatments with different time at 0.05 levelFig.6 The relative expression levels of TrFQR1 gene in leaves of Trifolium repens cv. ‘Ladino’ with different treatments

3 討 論

張通等[26]的研究表明，PwWrbA 蛋白由203個氨基酸組成，預測FMN結合位點在11～15和112～165氨基酸殘基處。與本試驗結果一致。從多系列比對及系統(tǒng)進化樹上看，白三葉TrFQR1與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆等植物也保持了高度相似性，說明TrFQR1進化的保守性。

查閱近20年來的相關文獻可知，前人已研究了醌氧化還原酶對FMN的清除[27]，對泛素非依賴性蛋白酶體的降解[28]，對超氧化物的清除[29]，以及對白念珠菌(Candidaalbicans)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[30-32]的致病性。這些研究中，醌氧化還原酶作為一種抗氧化劑，在電子傳遞，氧化應激，抵御疾病等方面發(fā)揮了非常重要的作用。但關于醌氧化還原酶生物通路的研究卻只有維生素K循環(huán)途徑。由此可見，盡管Kishko等[33]已經(jīng)研究了醌氧化還原酶與醌和 NAD(P)H的復合結構，但目前醌氧化還原酶的生物通路仍不全面，基因調(diào)控網(wǎng)絡也不清晰，在植物中的功能研究更是少之又少。

本試驗利用熒光定量PCR分析表明，TrFQR1的表達量在各非生物脅迫和信號刺激處理下，都有顯著變化。TrFQR1的表達量在PEG處理3 h、NaCl處理1.5 h、低溫處理6 h和CdSO4處理12 h時均有顯著變化；而SNP、NaHS、H2O2和CaCl2信號刺激處理1.5 h時，TrFQR1的表達量就有顯著變化。這說明TrFQR1對于信號刺激的響應更靈敏。在以上4種非生物脅迫中，TrFQR1的表達量在PEG處理3 h達到最大值，隨后降低，在12 h又升高，出現(xiàn)雙峰；低溫處理6 h，TrFQR1的表達量達到最小值；TrFQR1的表達量隨著NaCl處理時間延長而逐漸增加；而在CdSO4處理中，該基因的表達量在12 h才開始增加。因此TrFQR1的表達量對不同非生物脅迫的反應時間有差別，且響應方式不同。本試驗結果表明，白三葉TrFQR1編碼的醌氧化還原酶，能夠在多種非生物脅迫下發(fā)揮作用，并且受信號分子調(diào)控。由此可知，醌氧化還原酶不僅參與維生素K循環(huán)，也可能參與到植物生命活動的其他調(diào)節(jié)途徑中。但該基因在植物抗逆反應中的具體功能，參與的信號途徑和調(diào)控機制等還需要進一步研究。

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