韓 悅，史 佳，吳麗麗，張 圓，宮麗榮，余劍波

內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷是臨床危重癥患者死亡的主要原因，死亡率可高達(dá)35.1%～46.1%，其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜化決定了目前臨床治療措施的局限性[1-2]。電針刺激治療以傳統(tǒng)針灸為基礎(chǔ)，通過(guò)改變電刺激強(qiáng)度、頻率、波形脈沖間隔等參數(shù)而進(jìn)行行針治療[3]。前期研究已證實(shí)，電針刺激足三里和肺腧穴可通過(guò)上調(diào)血紅素氧合酶-1的表達(dá)而減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷，其機(jī)制涉及的信號(hào)通路尚不明確[4]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞骨架重組等重要功能[5]。研究表明，PI3K/Akt通過(guò)調(diào)整激動(dòng)蛋白微絲的排列及解聚，導(dǎo)致NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（keap1）復(fù)合體解體，參與Nrf2的活化，易位至細(xì)胞核識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)序列元件（ARE），從而激活下游抗氧化蛋白如HO-1等表達(dá)，維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)[6]。本研究擬評(píng)價(jià)PI3K/ Akt/Nrf2信號(hào)通路在電針刺減輕兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，有多組樣本均數(shù)比較的樣本含量公式估算出每組大概需要10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)按需分成8組，選擇健康清潔級(jí)雄性新西蘭大白兔80只，2月齡，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由天津市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供（許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0008）。于室溫18～22 ℃安靜環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)，晝夜交替，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采取隨機(jī)數(shù)字表法分為8組（n=10）：對(duì)照組（C組）、內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷模型組（L組）、PI3K/Akt抑制劑-渥曼青霉素+內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷組（WL組）、渥曼青霉素組（W組）、二甲基亞砜組（D組）、模型+電針刺組（EL）、模型+電針刺激非穴位組（SEL）、模型+電針刺+渥曼青霉素組（ELW）。

1.2 動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)前24 h禁食，自由飲水。參照文獻(xiàn)[7]制備內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷模型。耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 mL/kg麻醉后，仰臥位固定于自制兔臺(tái)上，經(jīng)耳緣靜脈置管建立靜脈輸液通路。頸部備皮消毒，1%利多卡因局麻下剪開(kāi)頸部正中皮膚，分離氣管和右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈分別行氣管插管和頸內(nèi)動(dòng)脈置管，維持自主呼吸，持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓，兔靜待30 min后，WL組、ELW組經(jīng)耳緣靜脈注射渥曼青霉素0.6 mg/kg（溶劑為0.08 mL/kg DMSO），D組給予等容量二甲基亞砜，其余組給予等容量生理鹽水。30 min后，L、WL、EL、SEL組及ELW組靜脈注射LPS 5 mg/kg（溶于2 mL 0.9%生理鹽水)，C、W及D組給予等容量生理鹽水。給予LPS后2 h內(nèi)MAP未降至基礎(chǔ)值75%或給予LPS后6 h內(nèi)動(dòng)物死亡的排除本研究。

參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》，選取兔雙側(cè)足三里穴（膝關(guān)節(jié)外下方腓骨小頭下約5 mm處）和肺俞穴（第3胸椎棘突下旁開(kāi)約1.5 cm處），將兔置于特制兔籠中，暴露針刺部位，常規(guī)備皮消毒，使用直徑0.3 mm的一次性無(wú)菌針灸針，直刺進(jìn)針5～7 mm。采用HANS2100A型疼痛治療儀進(jìn)行電針刺激，刺激時(shí)間9:30－10:30，30 min/次，1次/d，模型制備前1～4 d及模型制備過(guò)程中行電針處理。針刺參數(shù)為：疏密波，頻率2/15 Hz，波寬0.2～0.6 ms，刺激電流1～2 mA，刺激強(qiáng)度以兔肢體出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為宜。SEL組以相同的參數(shù)電針刺激足三里和肺俞穴旁開(kāi)0.5 cm非經(jīng)非穴處。

1.3 標(biāo)本采集與保存 靜脈注射LPS或生理鹽水后6 h，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈取血置于促凝管中，4 ℃離心取上清液置于EP管中于-80 ℃凍存。放血處死兔，留取雙肺組織，用4 ℃磷酸鹽緩沖鹽水洗去表面血漬，將右肺中葉組織浸入10%福爾馬林溶液中固定，右肺下葉組織置于液氮罐中速凍后于-80℃低溫冰箱保存。

取10%福爾馬林溶液固定的肺組織，經(jīng)梯度乙醇脫水置換，二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋，切片（4 μm），HE染色，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野于光學(xué)顯微鏡下觀察（×100），見(jiàn)圖1。參照文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行肺損傷評(píng)分，取其平均值作為總體的肺組織損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）肺泡充血和間質(zhì)水腫：無(wú)異常為0分，輕度異常為1分，中度異常為2分，重度異常為3分；（2）肺內(nèi)出血：無(wú)紅細(xì)胞為0分，極少數(shù)為1分，較多數(shù)為2分，充滿肺泡腔為3分；（3）肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集：無(wú)白細(xì)胞為0分，極少數(shù)為1分，較多數(shù)為2分，充滿肺泡腔為3分；（4）肺泡壁增厚和透明膜形成：無(wú)透明膜形成為0分，＜20%肺泡出現(xiàn)透明膜為1分，20%～50%肺泡出現(xiàn)透明膜為2分，＞50%肺泡出現(xiàn)透明膜為3分。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及及檢測(cè)方法 取-80 ℃保存的肺組織200 mg，制備10%組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行測(cè)定。SOD活性及MDA含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清TNF-α和IL-10濃度，取-80 ℃保存的血清，按兔TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒（R&D公司，美國(guó)）操作步驟加樣，用KHB ST-360酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中TNF-α和IL-10濃度。

采 用 Western blotting法 測(cè) 定 p-Akt、HO-1、Nrf2核蛋白及總蛋白的表達(dá)，取右肺下葉組織，按照Thermo蛋白提取試劑盒說(shuō)明分別提取核蛋白和總蛋白，離心取上清液后進(jìn)行蛋白定量。取80 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入兔p-Akt多克隆抗體（稀釋度1∶300）、兔Nrf2多克隆抗體（稀釋度1∶1000）和兔HO-1多克隆抗體（稀釋度1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（稀釋度1∶3000），室溫下避光搖床孵育1 h后漂洗。于暗室中加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光與顯色，使用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶積分光密度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平，見(jiàn)圖2。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量和IL-10濃度及SOD活性比較 與C組比較，L組、WL組、EL組、SEL組和ELW組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低（P＜0.05），W組、D組上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與L組比較，EL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量降低，而IL-10濃度及SOD活性升高，WL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低（P＜0.05），而SEL組上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＞0.05）；與EL組比較，ELW組組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低（P＜0.05）；與ELW組比較，WL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色×100)

2.2 p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平比較 與C組比較，L組、WL組、EL組、SEL組和ELW組肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），W組、D組上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與L組比較，EL組肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平上調(diào)，WL組肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），而SEL組上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＞0.05）；與EL組比較，ELW組肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；與ELW組比較，WL組肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖1 各組肺組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色×100)

圖2 各組p-Akt、HO-1、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)結(jié)果

表1 八組兔肺損傷評(píng)分、肺組織SOD活性、MDA含量、血清TNF-α及IL-10濃度比較（n=10，（±s）

表1 八組兔肺損傷評(píng)分、肺組織SOD活性、MDA含量、血清TNF-α及IL-10濃度比較（n=10，（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與L組比較，bP＜0.05；與EL組比較，cP＜0.05；與ELW組比較，dP＜0.05

組別 肺組織、損傷評(píng)分（分） SOD（U/mg） MDA（nmol/mg） TNF-α（ng/mL） IL-10（pg/mL）C組 0.7±0.4 102.3±6.9 1.69±0.23 1.35±0.11 7.69±0.64 L組 6.8±0.9a、c 67.6±3.8a、c 4.34±0.39a、c 3.14±0.23a、c 5.37±0.47a WL組 8.3±1.1a、b、d 42.3±2.6a、b、d 6.29±0.54a、b、d 4.62±0.32a、b、d 3.14±0.25a、b、d W組 0.9±0.5 106.9±7.3 1.61±0.22 1.37±0.13 7.63±0.71 D組 0.8±0.3 104.1±6.7 1.7±0.25 1.31±0.12 7.67±0.65 EL組 4.5±0.6a、b 87.5±5.6a、b 3.09±0.26a、b 2.03±0.18a、b 6.98±0.54a、b SEL組 6.5±0.7a、c 62.3±4.1a、c 4.31±0.35a、c 3.18±0.25a、c 5.34±0.43a、c ELW組 5.9±0.9a、c 57.4±3.5a、c 5.74±0.47a、c 3.96±0.28a、c 5.19±0.39a、c

表2 八組兔肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平比較（n=10，（±s）

表2 八組兔肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平比較（n=10，（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05；與L組比較，bP＜0.05；與EL組比較，cP＜0.05；與ELW組比較，dP＜0.05

組別 p-Akt蛋白 HO-1蛋白 Nrf2核蛋白 Nrf2總蛋白C組 1.07±0.14 0.23±0.03 0.36±0.05 1.45±0.21 L組 1.58±0.29a、c 0.67±0.09a、c 0.84±0.11a、c 2.14±0.43a、c WL組 1.23±0.21a、b、d 0.48±0.07a、b、d 0.61±0.09a、b、d 1.82±0.32a、b、d W組 1.09±0.13 0.25±0.03 0.34±0.04 1.47±0.23 D組 1.08±0.15 0.26±0.04 0.35±0.06 1.46±0.22 EL組 1.93±0.32a、b 1.05±0.12a、b 1.37±0.18a、b 3.25±0.58a、b SEL組 1.52±0.28a、c 0.69±0.08a、c 0.89±0.12a、c 2.18±0.45a、c ELW組 1.46±0.24a、c 0.74±0.09a、c 0.94±0.13a、c 2.46±0.49a、c

3 討論

靜脈注射LPS是目前制備內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷模型應(yīng)用最為廣泛的方法，LPS入血可引起機(jī)體中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等發(fā)生復(fù)雜的免疫反應(yīng)，釋放大量的炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子造成微循環(huán)障礙，誘發(fā)急性肺臟損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)以文獻(xiàn)[2]以及文獻(xiàn)[7]的前期研究為基礎(chǔ)，采用經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射LPS 5 mg/kg制備兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷模型，并以LPS給予2 h內(nèi)MAP下降至基礎(chǔ)值的75%及以下為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，給予LPS后肺組織形態(tài)學(xué)改變明顯，肺W/D比值、肺損傷評(píng)分升高，血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低，提示內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷模型制備成功。

電針穴位及針刺參數(shù)的選擇是影響電針刺激效果的重要因素[11]。足三里穴屬于足陽(yáng)明胃經(jīng)穴，肺腧穴屬于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)穴，前期研究已證實(shí)，電針刺激該穴位可產(chǎn)生肺保護(hù)作用，但具體作用機(jī)制尚不明確[12]。本研究參照文獻(xiàn)[4]以及文獻(xiàn)[10]設(shè)置電針參數(shù)，選取疏密波，頻率為2/15 Hz。結(jié)果表明，電針刺激兔雙側(cè)足三里及肺俞穴后，肺組織W/D比值降低，肺損傷評(píng)分降低，血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量降低，而IL-10濃度及SOD活性升高，表明電針刺減輕了內(nèi)毒素休克誘發(fā)的急性肺損傷。

PI3K是存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的脂激酶，能磷酸化細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇家族成員，募集和激活下游靶物質(zhì)而啟動(dòng)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Akt又稱(chēng)蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Akt/PKB是PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的下游靶激酶[13]。研究表明[14-15]，渥曼青霉素是非ATP競(jìng)爭(zhēng)型P13K抑制劑，0.6 mg/kg渥曼青霉素可成功阻斷P13K/Akt信號(hào)通路，且無(wú)死亡及急性毒性反應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇靜脈注射0.6 mg/kg渥曼青霉素作為阻斷劑行預(yù)處理。在本實(shí)驗(yàn)中，與L組比較，EL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量降低，而IL-10濃度及SOD活性升高，肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而WL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低，肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示電針刺激減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)的急性肺損傷，注射渥曼青霉素后可影響P13K/Akt信號(hào)通路，從而加重急性肺損傷。與ELW組比較，EL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量降低，而IL-10濃度及SOD活性升高，肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而WL組肺損傷評(píng)分、血清TNF-α濃度及肺組織MDA含量升高，而IL-10濃度及SOD活性降低，肺組織p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及總蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示電針刺激減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷被渥曼青霉素阻斷，表明PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)了電針刺減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷，其機(jī)制與激活Nrf2磷酸化，上調(diào)HO-1表達(dá)有關(guān)，HO-1不僅能夠抑制內(nèi)毒素休克急性肺損傷時(shí)TNF-α等炎性因子的釋放，還能抑制中性粒細(xì)胞的作用，減少中性粒細(xì)胞的聚集，來(lái)減輕炎癥反應(yīng)對(duì)肺組織的損傷[14]。電針刺激雙側(cè)足三里和肺腧穴，機(jī)械刺激和電信號(hào)被細(xì)胞表面受體接受后轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)激活PI3K/Akt通路，促使Nrf2活化并與Keap1解離，轉(zhuǎn)位入核，與伴侶蛋白小Maf形成異源二聚體，調(diào)控ARE依賴的靶基因HO-1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，調(diào)動(dòng)機(jī)體抗炎抗氧化應(yīng)激能力，從而減輕內(nèi)毒素誘發(fā)急性肺損傷[16]。

綜上所述，PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)電針刺激減輕兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)HO-1表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)，為內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷的防治提供了新思路及理論依據(jù)。

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