邢荷巖，宋志芳，胡孟娟

（ 1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

雞新城疫是養(yǎng)禽業(yè)首要注意的疾病之一，引起雞和多種禽類的急性、熱性、高度接觸性傳染病，每年給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前新城疫雖然在集約化養(yǎng)殖場(chǎng)得到了很好的控制，但是在散養(yǎng)雞中仍然是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題。非典型的雞新城疫是由1型禽副黏病毒引起的一種疫病，常見(jiàn)于規(guī)?；酿B(yǎng)雞場(chǎng)，嚴(yán)重影響了雛雞的正常生長(zhǎng)，造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋效率大幅下降。當(dāng)前依據(jù)非典型新城疫的臨床癥狀和病理學(xué)變化與典型新城疫進(jìn)行區(qū)別，進(jìn)行新城疫的初步診斷，然而大部分非典型新城疫的發(fā)病和死亡率比典型新城疫低，可通過(guò)疫苗免疫接種方法來(lái)降低非典型的新城疫發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。對(duì)332次非典型的新城疫病例進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，非典型新城疫的疾病發(fā)生大多在春天5月開(kāi)始逐漸地上升至春季6月，而夏天則從7月開(kāi)始下降至8月，然而到秋天的9月又呈現(xiàn)急劇的上升趨勢(shì)[4]。

1 材料與方法

檢測(cè)分析永年縣蛋雞新城疫的免疫抗體水平，分別對(duì)不同批次的蛋雞群隨機(jī)選取80只，通過(guò)翼靜脈采血分離血清。依據(jù)《新城疫診斷技術(shù)規(guī)范》（GB16550-2008），采用血凝抑制試驗(yàn)對(duì)血清樣品中的新城疫免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)[5]。

1.1 材料

1.1.1 待檢雞群

永年縣某雞場(chǎng)蛋雞，選取7日齡、22日齡、35日齡、60日齡、120日齡的蛋雞群各10個(gè)，每個(gè)雞群隨機(jī)選取8只。

1.1.2 器材

濾紙、試管、試管架、高壓滅菌器、離心機(jī)、離心管、內(nèi)徑2 mm聚乙烯塑料管100 cm、三棱針、酒精燈、注射器（2.5 mL）、石蠟、0.025 mm微量吸液器、96孔V型微量凝集試驗(yàn)板、恒溫培養(yǎng)箱、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。

1.1.3 藥品

標(biāo)準(zhǔn)抗原（實(shí)驗(yàn)室提供）；生理鹽水（實(shí)驗(yàn)室提供）；3.8%枸櫞酸鈉（實(shí)驗(yàn)室配制）；1%的雞紅細(xì)胞懸液（實(shí)驗(yàn)室自制）；待檢血清（永年縣選取的雞群采血后制備）。

1.2 方法

1.2.1 1%紅細(xì)胞懸液的配置

在雞翅靜脈或心臟采10 mL的血液，并且將其與枸櫞酸鈉抗凝劑混勻后，取5 mL的血樣和95 mL生理鹽水一起加入2個(gè)離心管中，2 000 r·min-1離心5 min，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將已經(jīng)沉淀的紅細(xì)胞中加入稀釋液（既生理鹽水）中洗滌。再2 000 r·min-1離心5 min，吸去其中的上清液再把上面的操作步驟重復(fù)3～4次。結(jié)束操作后，用微量加樣器吸5ul的紅細(xì)胞加入495 uL理鹽水中，再充分的混勻最后則制成了1%紅細(xì)胞混懸液。

1.2.2 被檢血清的制備

在永年縣隨機(jī)選取7日齡、22日齡、35日齡、60日齡、120日齡的蛋雞群各10個(gè)，每個(gè)雞群隨機(jī)選取8只蛋雞共400只蛋雞，分別編好號(hào)后再登記，然后用已經(jīng)消過(guò)毒的干燥的注射器采血，將血液注入干凈且干燥的試管內(nèi)，在室溫中靜置或離心等待血清徹底的析出后再使用[6]。注意不能同時(shí)把一個(gè)注射器用于倆個(gè)及以上的雞只。

1.2.3 雞新城疫抗體水平檢測(cè)

現(xiàn)采用微量法來(lái)進(jìn)行雞新城疫病毒的HA試驗(yàn)與HI試驗(yàn)，再用u或v形微孔塑料板來(lái)代替經(jīng)常使用的試管[7]。在其試驗(yàn)前需要首先檢查血清有無(wú)凝集特性，如果發(fā)現(xiàn)其血清有凝集特性則需用雞紅細(xì)胞對(duì)血清進(jìn)行吸附。

血液凝集（HA）試驗(yàn)具體的操作步驟：首先用移液器向每個(gè)孔加入稀釋液1滴；用微量移液器取病毒抗原0.05 mL，加入第1孔，反復(fù)抽動(dòng)6次后，吸出0.05 mL加入第2孔，在第2孔反復(fù)抽動(dòng)6次后，吸出0.05 mL孔，如此連續(xù)稀釋至第11孔后吸出0.05 mL棄去。第12孔不加病毒液為紅細(xì)胞空白對(duì)照；換吸頭再吸取1%雞紅細(xì)胞懸浮液依次加入到第1～12孔，每孔加入0.05 mL；放在振蕩器上震蕩1～2 min，在室溫條件下靜置（約21℃）40 min，或者恒溫培養(yǎng)箱37℃下作用5～10 min，當(dāng)對(duì)照孔的紅細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的紐扣狀時(shí)來(lái)判定[8]。

判定血凝特性：將凝集反應(yīng)板傾斜，后再觀察其中有沒(méi)有線狀流淌，完全凝集是如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，表明紅細(xì)胞被病毒所凝集。最高稀釋倍數(shù)作為血凝效價(jià)，這表示1個(gè)血凝單位，然后再根據(jù)初始的稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算血凝的效價(jià)。也就是病毒液的HA效價(jià)以出現(xiàn)了完全凝集的抗原最大稀釋度為準(zhǔn)。HI試驗(yàn)時(shí)，病毒抗原液為0.05mL內(nèi)須含4個(gè)的凝集單位，如上所說(shuō)的應(yīng)該將原病毒液作成64/4=16倍的稀釋液[9]。

紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)： 因?yàn)樾鲁且叩牟《居心t細(xì)胞的作用，且能被特異性抗體所抑制，因此可用血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定被檢雞血清中的HI抗體效價(jià)（即滴度），能用標(biāo)準(zhǔn)血清作為新分離病毒的鑒定與未知病毒的診斷測(cè)定。

具體操作如下：用移液器向每孔加0.05 mL稀釋液，11孔加0.1 mL的稀釋液；再用移液器吸取被檢血清（或高免卵黃抗體）0.05 mL注入第1孔，抽放6次后，吸出0.05 mL，注入第2孔內(nèi)，如此連續(xù)稀釋至第10孔，并從第10孔吸出0.05 mL棄去，血清稀釋倍數(shù)依次為1：2～1 024，11孔和12孔空白；每孔再加入已標(biāo)定好的四單位病毒液0.05 mL，第11孔為紅細(xì)胞對(duì)照孔，其內(nèi)不加病毒液；置于振蕩器上振蕩上1 min，放在19～21℃靜置20 min；每孔再加入0.7%紅細(xì)胞懸浮液0.05 mL，放振蕩器上振蕩1 min，置于19～21℃下，30～60 min后再判定其結(jié)果；第11孔作為紅細(xì)胞對(duì)照孔，第12孔作為抗原對(duì)照孔。

結(jié)果觀察：首先將反應(yīng)板傾斜成45℃，觀察沉于管底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流淌者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，表明紅細(xì)胞被病毒所凝集[10]。

將4單位的病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)，以被檢動(dòng)物血清的稀釋倍數(shù)或以2為底的對(duì)數(shù)來(lái)表示。第11孔僅含稀釋液和紅細(xì)胞為不凝集對(duì)照孔，第12孔含稀釋液，病毒液和紅細(xì)胞為凝集對(duì)照孔。

2 試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)不同批次的蛋雞群隨機(jī)選擇，翼靜脈采血，分離血清。依據(jù)《新城疫診斷技術(shù)規(guī)范》（GB16550-2008），采用血凝抑制試驗(yàn)對(duì)血清樣品中的新城疫免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)。

表1 永年縣7日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

2.1 7日齡各雞群新城疫抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

永年縣7日齡蛋雞新城疫的抗體水平見(jiàn)表1。

由表1可知，永年縣7日齡的蛋雞抗體水平大部分都集中在1～4滴度，其平均抗體水平集中在2～3，抗體水平低需要進(jìn)行全方面合理的疫苗接種，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等方面來(lái)提高7日齡蛋雞的抗體水平。

2.2 22日齡各雞群新城疫抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

永年縣22日齡蛋雞新城疫的抗體水平見(jiàn)表2。

由表2可知，永年縣22日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在2～7滴度，其平均抗體水平集中在3～5，抗體水平也比較低需要進(jìn)行全方面的合理的疫苗接種，并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等方面來(lái)提高22日齡蛋雞的抗體水平。

2.3 35日齡各雞群新城疫抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

永年縣35日齡蛋雞新城疫的抗體水平見(jiàn)表3。

由表3可知，永年縣35日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在4～9滴度，其平均抗體水平集中在6.25～8.37，35日齡的蛋雞的抗體水平很明顯比7日齡和22日齡的蛋雞有了顯著的提高，制定合理的飼養(yǎng)管理程序保持蛋雞有較高的抗體水平。

2.4 60日齡各雞群新城疫抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

永年縣60日齡蛋雞新城疫的抗體水平見(jiàn)表4。由表4可知，永年縣60日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在7～11滴度，其平均抗體水平集中在8～10.12，60日齡的蛋雞的抗體水平很明顯比35日齡的蛋雞抗體水平有了顯著的提高，制定合理的飼養(yǎng)管理程序保持蛋雞有較高抗體水平。

表2 永年縣22日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

表3 永年縣35日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

表4 永年縣60日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

2.5 120日齡各雞群新城疫抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

永年縣120日齡蛋雞新城疫的抗體水平見(jiàn)表5。

由表 5可知，永年縣120日齡的蛋雞的抗體水平大部分都集中在9～12滴度，其平均抗體水平集中在9.87～11.25，120日齡蛋雞的抗體水平很明顯又比60日齡的蛋雞有了顯著的提高，同時(shí)制定合理的飼養(yǎng)管理程序可以保持蛋雞有較高的抗體水平。由此根據(jù)測(cè)定的結(jié)果來(lái)調(diào)整免疫接種的時(shí)間，可看出＞60日齡的蛋雞免疫程序比較合理，保持合理的飼養(yǎng)管理方式，可全方面的預(yù)防蛋雞新城疫疾病。

表5 永年縣120日齡蛋雞新城疫的抗體水平（Log2）

3 結(jié) 論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)永年縣蛋雞新城疫的檢測(cè)與分析的研究對(duì)雞新城疫方面的知識(shí)有更深入的了解，雞群接種新城疫疫苗后，再測(cè)血清中的HI抗體效價(jià)，若HI抗體效價(jià)無(wú)明顯的提高，則表示其免疫失敗，因此平時(shí)也應(yīng)該多加注意疫苗的合理的使用即疫苗的免疫途徑、疫苗的免疫接種、免疫接種的時(shí)間、免疫程序、免疫劑量等因素。為更好的預(yù)防和控制蛋雞新城疫疾病的發(fā)生，除做好了解以上相關(guān)問(wèn)題外還需要對(duì)蛋雞新城疫疾病的本質(zhì)有進(jìn)一步的了解，因此需不斷的研究和探討[11-12]。

本次試驗(yàn)使用血凝和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)邯鄲市永年縣某雞場(chǎng)的雞新城疫抗體檢測(cè)，判斷本地區(qū)新城疫免疫保護(hù)效果 ，試驗(yàn)結(jié)果表明，永年縣7日齡和22日齡的蛋雞抗體水平較低，35日齡和60日齡蛋雞抗體水平稍微上升，抗體水平離散程度降低，120日齡抗體水平明顯增加，其離散程度也明顯降低。結(jié)果表明，現(xiàn)有的免疫程序完全可以保護(hù)雞群免受新城疫病毒的侵襲。

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