邱筱椿，王玲玲

(上饒市中心血站，江西 上饒 334000)

目前，臨床輸血治療是一種無(wú)法替代的治療手段，有時(shí)甚至是搶救生命的首要和必要手段。但是，輸血傳播病毒是臨床輸血安全最大的隱患，盡管采用血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)已使輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)得到有效的降低，但仍存在檢測(cè)“窗口期”較長(zhǎng)、病毒滴度低、免疫靜默性感染和病毒變異等因素，使臨床輸血安全依然存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[1]。因?yàn)椴《靖腥救梭w后會(huì)依次經(jīng)歷復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄、翻譯3個(gè)階段。血液篩查使用的酶聯(lián)免疫（ELISA）技術(shù)，只能檢測(cè)病毒翻譯表達(dá)的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（即抗原或抗體），而對(duì)前2個(gè)階段的產(chǎn)物——核酸卻無(wú)能為力。核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）具有高靈敏度和特異性及低污染風(fēng)險(xiǎn)的特點(diǎn)。不僅彌補(bǔ)了常規(guī)酶聯(lián)免疫技術(shù)的缺點(diǎn)，而且作為酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的補(bǔ)充可進(jìn)一步降低輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)，顯著縮短血液感染病毒的檢測(cè)“窗口期”。為了進(jìn)一步提高血液質(zhì)量的保證輸血安全，本血站于2014年7月對(duì)獻(xiàn)血者血液篩查標(biāo)本開(kāi)展高靈敏的核酸檢測(cè) （NAT）技術(shù)。初步探討NAT應(yīng)用于本地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者血液篩查的必要性?，F(xiàn)將2015年1月-2016年8月獻(xiàn)血者血液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2015年1月-2016年8月本血站采集的無(wú)償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本，獻(xiàn)血者均符合國(guó)家 《獻(xiàn)血者健康檢測(cè)要求》，經(jīng)體檢和快速篩查（HBsAg、抗-TP、ALT）合格后采集的血液標(biāo)本共54750例，每位獻(xiàn)血者采集血液同時(shí)留取3管血液標(biāo)本，第1管5ml用EDTA-K2抗凝的真空采血管用于常規(guī)ELISA和ALT的檢測(cè)，第2管3ml用EDTA-K2抗凝的真空采血管用于血型檢測(cè)，第3管5ml用無(wú)菌、無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶帶惰性分離膠的EDTA-K2抗凝的BD真空采血管用于核酸（NAT）檢測(cè)，其中NAT檢測(cè)標(biāo)本采集后用低溫冷凍離心機(jī)3000r/min離心20min后與2-8℃冰箱保存，并與72h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 ELISA檢測(cè)試劑，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP檢測(cè)試劑盒由廈門(mén)英科新創(chuàng)科技有限公司和北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，ALT檢測(cè)試劑盒由上海榮盛科技有限公司和上?？迫A有限公司提供，乙肝兩對(duì)半試劑盒由廈門(mén)英科新創(chuàng)科技有限公司提供.核酸檢測(cè)試劑.羅氏 Cobas TaqScreen MPx V2.0 HBV、HCV、HIV NAT聯(lián)合檢測(cè)試劑盒由美國(guó)羅氏診斷公司提供，所有試劑均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，并在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 主要儀器 ELISA檢測(cè)使用，Hamilton STAR全自動(dòng)加樣儀和FAME酶免分析儀 （瑞士HAMILTON公司），ALT檢測(cè)使用，日立7020全自動(dòng)生化分析儀（日立公司）。核酸檢測(cè)使用羅氏診斷Cobas’S201血液核酸篩查平臺(tái)：Hamilton STAR全自動(dòng)樣儀 （瑞士 HAMILTON公司），Cobas Ampiprep核酸提取儀和Cobas Taqman Ama Lyier核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀通過(guò)混樣和數(shù)據(jù)管理服務(wù)器(PDM)連接組成血篩平臺(tái)。

1．3 檢測(cè)流程

1．3．1 常規(guī)檢測(cè) 所有獻(xiàn)血者標(biāo)本均按照國(guó)家 《獻(xiàn)血者健康檢查要求》進(jìn)行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、ALT、血型的全項(xiàng)檢測(cè)，由不同的檢測(cè)人員，采用2種不同廠家的試劑，使用不同的檢測(cè)儀器進(jìn)行2遍全項(xiàng)的平行檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和判定結(jié)果，當(dāng)標(biāo)本HBsAg/抗-HCV/抗-HIV/抗-TP/ALT 2種試劑檢測(cè)結(jié)果均為反應(yīng)性判為不合格，2種試劑檢測(cè)結(jié)果均為無(wú)反應(yīng)性則判為合格，若只有一種試劑檢測(cè)為反應(yīng)性的則用該試劑對(duì)原血樣做雙孔復(fù)試，雙孔復(fù)試結(jié)果均為無(wú)反應(yīng)性的結(jié)果判合格，雙孔復(fù)試結(jié)果中任何1孔為反應(yīng)性的結(jié)果判為不合格?？?HIV為反應(yīng)性的樣本送HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證，所有試驗(yàn)均按試劑盒說(shuō)明書(shū)在實(shí)驗(yàn)室管理軟件中編定程序，自動(dòng)判讀結(jié)果。

1．3．2 核酸檢測(cè) 對(duì)常規(guī)檢測(cè)合格標(biāo)本做核酸（NAT）檢測(cè)，采用羅氏 Cobas TagScreen MPx Test Version 2.0二代試劑，由全自動(dòng)混樣儀自動(dòng)混樣，每 6份標(biāo)本（167ul/份）混成 1份（1ml）作為一級(jí)混樣池（PooL）標(biāo)本，由全自動(dòng)核酸提取和全自動(dòng)核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行HBV-HCV-HIV NAT檢測(cè)，每批檢測(cè)均設(shè)置1個(gè)陰性質(zhì)控和5個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控（HIV-1 M組 RNA 、HIV-1 O 組 RNA、HIV-2 RNA、HCV RNA、HBV DNA）。每個(gè)PooL均含有內(nèi)對(duì)照，如果混樣PooL的檢測(cè)為無(wú)反應(yīng)性，則6份標(biāo)本結(jié)果為合格，如果混樣PooL檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)性，對(duì)該P(yáng)ooL中6份標(biāo)本進(jìn)行拆分檢測(cè)，單樣本拆分檢測(cè)結(jié)果作為該樣本最終檢測(cè)結(jié)果，單樣本的最終拆分檢測(cè)可直接區(qū)分報(bào)告HIV、HCV和HBV病毒為反應(yīng)性。

1．3．3 NAT陽(yáng)性獻(xiàn)血者的血清學(xué)補(bǔ)充試驗(yàn) 目前本血站NAT檢測(cè)陽(yáng)性只發(fā)現(xiàn)HBV DNA陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本做乙肝兩對(duì)半檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 2015年1月至2016年8月共采集獻(xiàn)血者標(biāo)本54750例，其中輸血傳染性指標(biāo)血清學(xué)檢測(cè)合格標(biāo)本為54049例，不合格標(biāo)本為701例，不合格率為1.28%，具體見(jiàn)表1。

2.2 核酸檢測(cè)標(biāo)本54049例，共檢出HBV DNA陽(yáng)性139例，陽(yáng)性反應(yīng)率為0.26%，具體見(jiàn)表2。

表1 54750例獻(xiàn)血者血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果情況

表2 ELISA陰性標(biāo)本NAT檢測(cè)結(jié)果

2.3 139例HBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果共有6種模式分別以A-F表示，具體見(jiàn)表3。

表3 139例HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本乙肝兩對(duì)半檢測(cè)模式

3 討論

本血站獻(xiàn)血者輸血傳染性指標(biāo)血清學(xué)檢測(cè)的不合格率為1.28%，低于撫州地區(qū)4.12%（1631/39599）[2]、新余市 3.78%（1706/45078）[3]和婁底地區(qū)3.92%（2427/61929）[4]，這主要是本血站在獻(xiàn)血者采血前的初篩檢測(cè)中做了HBsAg、抗-TP和ALT的快速檢測(cè)有關(guān)。對(duì)常規(guī)檢測(cè)合格的54049例標(biāo)本進(jìn)一步用NAT技術(shù)檢測(cè)，檢出139例陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性檢出率為0.26%，與南昌地區(qū)的0.24%（194/79414）[5]和龍巖地區(qū)的 0.24%（47/19922）[6]很接近，明顯高于烏魯木齊市的0.11%（62/57644）[7]和常州地區(qū)的0.10%（19/17220）[8]。此139例陽(yáng)性標(biāo)本均為HBV DNA陽(yáng)性，未檢出HCV RNA陽(yáng)性和HIV RNA陽(yáng)性標(biāo)本（0/54049）原因分析：可能是①本地區(qū)為HCV和HIV的低流行區(qū)，②常規(guī)ELISA兩種試劑組合互補(bǔ)有效的檢出了HCV和HIV抗體陽(yáng)性的標(biāo)本，③HBV是DNA病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，而HCV和HIV均為RNA病毒，這與RNA的生物學(xué)特性有關(guān)[9]，RNA為單鏈病毒，不穩(wěn)定容易分解和變異，④由于開(kāi)展NAT檢測(cè)時(shí)間不長(zhǎng)，標(biāo)本量不夠大，所以未檢測(cè)出HCV RNA和HIV RNA陽(yáng)性標(biāo)本。表3結(jié)果顯示，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)HBsAg陰性而NAT檢測(cè)HBV DNA陽(yáng)性的139例標(biāo)本乙肝兩對(duì)半結(jié)果，其中HBcAb陽(yáng)性占92.08%，HBcAb和HBeAb同時(shí)陽(yáng)性的占41.7%，此現(xiàn)象的發(fā)生有可能為HBsAg急性感染的窗口期，亦可能為既往感染過(guò)HBV或是急性感染的恢復(fù)期，也可能為基因突變形成新的變異株。

終上所述，本次調(diào)查表明本地區(qū)仍屬我國(guó)HBV相對(duì)的高流行區(qū)，而且隱匿性感染和窗口期的HBV是目前本地區(qū)影響酶免陰性血液安全的主要因素，NAT檢測(cè)能有效的篩查出ELISA檢測(cè)合格為HB-sAg無(wú)反應(yīng)性的HBV感染標(biāo)本，是確保血液安全的另一種有效的檢測(cè)手段。NAT檢測(cè)能將窗口期大大縮短[1，10]，其中 HBV 為 6-15d，HCV 為 41-60d，HIV為10-15d。所以在獻(xiàn)血者血液檢測(cè)中以ELISA結(jié)合NAT檢測(cè)在方法學(xué)上有很好的互補(bǔ)性，《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015）版》已明確輸血相關(guān)傳染病的檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法，必須用核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA檢測(cè)。采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)選擇合適的核酸檢測(cè)系統(tǒng)，加強(qiáng)操作人員的培訓(xùn)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，做好儀器設(shè)備的日常維護(hù)保養(yǎng)工作及試劑性能確認(rèn)管理，保證核酸檢測(cè)結(jié)果的有效性，有效地提高輸血安全，保障臨床用血安全。

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