李冰潔，張 睿，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

酸棗仁(SemenZizyphiSpinosae，SZS)為鼠李科(Phamnaceae)棗屬植物酸棗[ZizyphusjujubaMill.varspinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou]的干燥成熟種仁[1]，分布于中國西北、東北、華北及南方一些地區(qū)，有寧心志、安魂魄、止虛汗、解渴除煩、安

神養(yǎng)血、益肝補(bǔ)中之功效[2]。酸棗仁皂苷是酸棗仁的水溶性成分，酸棗仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)是其中的主要有效成分[3]。研究表明，JuA對海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，能明顯提高海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率，且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性[4]。此外，JuA作為抗炎、抗氧化的神經(jīng)保護(hù)藥物作用于阿爾茨海默病[5]，表明JuA對神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的膠質(zhì)細(xì)胞，作為神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)提供營養(yǎng)，維持神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和廣泛維持腦內(nèi)環(huán)境平衡[6-7]。近年來研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥。這些神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制都與星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷相關(guān)[8-9]。氧化損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞將不能正常行使對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)功能，并產(chǎn)生一系列的改變，如減弱或逆轉(zhuǎn)其清除自由基、攝取谷氨酸、調(diào)節(jié)細(xì)胞外K+等作用，從而使原始損傷加重，促進(jìn)神經(jīng)損害的發(fā)展[10]。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷可能是神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的一個(gè)重要方向。JuA對神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道JuA對星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷具有干預(yù)作用。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化性損傷模型，研究JuA對星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，從而探討JuA是否可以通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料

1.1 試劑 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞C6：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；JuA(分子式C58H94O26，分子量1 207.35，批號 55466-04-1，純度>95%)：南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；批號 11012-8611)：杭州四季青生物工程材料有限公司；LPS(批號 L2630)、胰蛋白酶(批號 0458)、Griess試劑(批號 03553)和DMSO(批號 D2650)：Sigma；DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素；批號 12500-062)：Gibco BRL公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2；批號 1233009)：Sigma進(jìn)口分裝，沃德賽斯生物公司；L-噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT；批號 PB180520]：Sigma分裝，武漢生命技術(shù)有限公司；膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP；批號 ab10062)抗體：Abcam；青霉素-鏈霉素溶液(批號 C0222)、活性氧檢測試劑盒(含DCFH-DA染料；批號 S0033)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(批號 S0131)、總谷胱甘肽(L-glutathione，GSH)檢測試劑盒(批號 S0052)和總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(批號 S0101)：上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器 高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy KOQYO公司；MCO-175型CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型潔凈工作臺：蘇凈集團(tuán)安泰公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；LD4-8型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀：美國MD公司；流式細(xì)胞儀：美國Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 C6細(xì)胞培養(yǎng) 將C6細(xì)胞用37 ℃水浴復(fù)蘇，待完全融化后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，選用DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%～90%，按照1∶2或1∶3比例傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測JuA對C6細(xì)胞活力的影響 選取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的C6細(xì)胞，胰酶消化，細(xì)胞懸液按照每孔1×104密度接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，空白對照組加入等容積PBS；待細(xì)胞貼壁后，正常對照組換用完全培養(yǎng)基，給藥組加入不同濃度(0.125、1.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的JuA培養(yǎng)24 h，再每孔加入50 mg/mL的MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)基，加入150 μL的DMSO，置于搖床上震蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔吸光度值。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式：存活率=(給藥組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

2.3 Western blot檢測GFAP蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期C6細(xì)胞，以1×105密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，分成正常對照組、模型組和給藥組。正常對照組正常培養(yǎng)，未加JuA和LPS，模型組將濃度為1 μg/mL的LPS加至C6細(xì)胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h[11]；給藥組用12.5、25、50 μmol/L JuA干預(yù)4 h，其他處理方法與模型組相同。孵育24 h后，在低溫條件下用細(xì)胞裂解液(含PMSF)提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。使用10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳和濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；再用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；在4 ℃下加一抗(1∶2 000)孵育過夜。次日，用PBST每隔10 min洗膜1次，共3次；在含有HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h后，PBST洗膜。最后，配制ECL試劑，曝光，分析。

2.4 Griess法檢測一氧化氮(nitric oxide, NO)水平 選用對數(shù)生長期C6細(xì)胞，胰酶消化后將細(xì)胞懸液以每孔1×105的密度接種于24孔板中，每孔1 mL。待細(xì)胞貼壁后，按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理，24 h后收集細(xì)胞上清，以每孔100 μL加至96孔板中，再加入100 μL Griess試劑，37 ℃避光孵育10 min，使用酶標(biāo)儀在540 nm處測定吸光度值。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中活性氧族(reactive oxygen species，ROS)含量 取對數(shù)生長期C6細(xì)胞，消化收集后，取每孔4×105的細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔2 mL。待細(xì)胞在培養(yǎng)箱中完全貼壁，按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理，24 h后，小心吸取培養(yǎng)液，胰酶消化后離心，用PBS清洗重懸后，加入含有DCFH-DA熒光染料的無血清培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育30 min，每隔10 min震蕩離心管，使熒光探針與細(xì)胞充分接觸；再用PBS洗滌3次，去除多余的熒光染料，重懸收集細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀上以激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm進(jìn)行檢測。

2.6 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH水平和SOD活性的檢測 按“2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行分組、給藥與種板培養(yǎng)，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，小心吸取培養(yǎng)液，PBS清洗后，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞；將裝有細(xì)胞懸液的離心管置于冰水浴中，使用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞(超聲時(shí)間3 s，間隔時(shí)間5 s，共5次)，再收集上清液，按檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定MDA、GSH水平和SOD活力。

3 結(jié)果

3.1 JuA對C6細(xì)胞存活率的影響 0.125～50 μmol/L JuA作用C6細(xì)胞24 h后，與正常對照組(0 μmol/L JuA組)相比，C6細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)，表明此濃度范圍內(nèi)，藥物對細(xì)胞生長無明顯影響。見圖1。

注：與正常對照組比較，*P<0.05

3.2 JuA對LPS誘導(dǎo)的C6細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較,模型組GFAP蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；12.5～50 μmol/L JuA作用細(xì)胞24 h后，與模型組比較，各給藥組GFAP蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

3.3 JuA對LPS誘導(dǎo)的C6細(xì)胞內(nèi)NO水平的影響 與正常對照組(0 μmol/L LPS+0 μmol/L JuA)比較，模型組(1 μmol/L LPS)NO水平明顯升高(P<0.05)；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6細(xì)胞24 h后，各給藥組NO水平較模型組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，50 μmol/L JuA單獨(dú)作用細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)NO水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 JuA對LPS誘導(dǎo)的C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 與正常對照組(0 μmol/L LPS+0 μmol/L JuA)比較，1 μg/mL LPS作用C6細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.05)；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6細(xì)胞24 h后，各給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05)。見圖4。

3.5 JuA對LPS誘導(dǎo)的C6細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH水平和SOD活性的影響 與正常對照組(0 μmol/L LPS+0 μmol/L JuA)比較，模型組C6細(xì)胞內(nèi)MDA表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，GSH水平和SOD活性則明顯降低(P<0.05)；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6細(xì)胞24 h后，與模型組比較，各給藥組MDA水平明顯降低(P<0.05)，GSH水平和SOD活性明顯增加(P<0.05)。見圖5、圖6和圖7。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

LPS由細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞而釋放出來，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的成分，是一種內(nèi)毒素；LPS刺激機(jī)體產(chǎn)生的大量ROS自由基會導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。以LPS誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激模型已在許多研究中得到應(yīng)用，如用LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，研究紫菀抗氧化和抗炎的作用機(jī)制[13]。

GFAP是一種Ⅲ型中間絲狀蛋白，以單體形式存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中[14]，在細(xì)胞骨架重新建立、細(xì)胞間的黏附、髓靴之間的連接及多種信號的傳導(dǎo)途徑等細(xì)胞活動中具有重要意義，GFAP僅存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞，具有標(biāo)志性[15]；因此可利用GFAP特異性抗體來檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組比較，模型組C6細(xì)胞內(nèi)GFAP蛋白活性顯著上調(diào)(P<0.05)，表明LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性增強(qiáng)；各濃度JuA可以有效地下調(diào)GFAP蛋白表達(dá)(P<0.05)，表明JuA具有一定的降低星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的作用。

NO是一種簡單卻不穩(wěn)定的自由基，參與多種生理和病理過程。大量NO與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，生成的過氧化亞硝酸陰離子，氧化性極強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化損傷，引發(fā)神經(jīng)退行性疾病[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LPS作用后，細(xì)胞內(nèi)NO釋放明顯增加；與模型組比較，JuA給藥組可以顯著抑制C6細(xì)胞NO的釋放(P<0.05)，表明JuA可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放。

氧化應(yīng)激最直接的表現(xiàn)就是在機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)，ROS生成加劇會導(dǎo)致氧化和抗氧化水平失衡，所引起的生物化學(xué)變化則會導(dǎo)致各種病理過程，尤其是神經(jīng)退行性疾病。神經(jīng)退行性疾病的形態(tài)特征是特異性易感神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)進(jìn)行性細(xì)胞損失，通常與細(xì)胞骨架蛋白聚集體在神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中形成內(nèi)含物相關(guān)。異常聚集的蛋白質(zhì)和被破壞的金屬離子穩(wěn)態(tài)都與氧化應(yīng)激高度相關(guān)[17]。MDA、GSH、SOD都是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，是檢測氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量可以間接地反映氧化應(yīng)激和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的程度。GSH可去除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和通過有機(jī)過氧化反應(yīng)所生成的毒物，具有保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷，維持細(xì)胞膜還原狀態(tài)的作用。SOD則是以超氧陰離子為底物的抗氧化酶，在維持生物機(jī)體內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡中起著極其重要的作用，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[18-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，LPS組C6細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平明顯升高，GSH水平和SOD活性明顯降低，表明LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了氧化損傷；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6細(xì)胞24 h后，C6細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、GSH水平和SOD活性均有明顯的改善(P<0.05)，表明各濃度JuA可以減弱細(xì)胞氧化損傷的程度。

綜上所述，JuA具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的C6細(xì)胞氧化損傷作用，本實(shí)驗(yàn)為JuA防治神經(jīng)退行性疾病提供了一定的理論依據(jù)。

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