徐海寧，劉玉梅*

近年來，隨著人們對食品安全的認識和保健要求的逐步提高，合成食品添加劑的潛在危害受到各界廣泛關(guān)注[1-2]，尋找和開發(fā)天然來源的食品添加劑已成為功能性食品領(lǐng)域研究的熱點[3-4]。如天然來源的納他霉素、殼聚糖以及乳酸鏈球菌素[5]等均在發(fā)揮防腐作用的同時也具有其他重要的生理功效。啤酒花中重要的樹脂成分β-酸，在啤酒釀造中不但具有協(xié)調(diào)風味、彌補苦味不足等作用，更重要的是具有明顯的抑菌作用。但β-酸化學性質(zhì)活潑，極易被氧化[6]，直接作為食品抑菌或防腐劑不易利用。然而，通過控制一定的反應(yīng)條件，將β-酸加氫還原[7]，得到的氫化衍生物六氫β-酸（hexahydroβ-acids，HH）不但具有比β-酸更好的穩(wěn)定性[8]，且在抗菌[9]、防腐、抗氧化[10]和抑制腫瘤生長[11-12]等方面也呈現(xiàn)出更強的生物活性。但不足之處是，HH的疏水性很強，會在一定程度上限制其使用范圍。環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）及其衍生物是由多個D-吡喃葡萄糖形成的具有“錐筒”狀的“內(nèi)疏水，外親水”的化合物，其特殊的空腔以及內(nèi)部的疏水環(huán)境能與一些極性、大小、理化性質(zhì)相匹配的客體分子或基團形成包合物，對提高客體分子的穩(wěn)定性，改善客體分子的溶解性，以及緩釋效果等方面有較大的影響[13-14]。目前，在很多藥物研發(fā)中常采用CD包合以增加藥物分子的水溶性。通過前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，采用CD及其衍生物包合可明顯改善HH的水溶性，進而可達到擴展其在更多食品中應(yīng)用的目的，但HH與各種食品中常用添加劑之間是否存在相互作用尚鮮見文獻報道。

本研究在比較了7 種HH-CD包合物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH活性的基礎(chǔ)上，篩選出4 種HH-CD包合物，分別與食品添加劑檸檬酸，氯化鈉（sodium chloride，NaCl），蔗糖，VC等進行單獨和混合復配，考察復配溶液體系對DPPH自由基和·OH清除活性；通過計算協(xié)同系數(shù)，評價HH-CD包合物與上述食品添加劑的協(xié)同抗氧化活性。通過上述研究，以期為天然來源的HH作為功能性食品抑菌防腐劑的應(yīng)用和開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HH（純度≥99%）、六氫β-酸-2-甲基-β-環(huán)糊精（hexahydro-β-acids-2-methyl-β-cyclodextrin，HH-M-β-CD）、六氫β-酸-γ-環(huán)糊精（hexahydro-β-acids-γcyclodextrin，HH-γ-CD）、六氫β-酸-羥丙基-β-環(huán)糊精（hexahydro-β-acids-hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HH-HP-β-CD）、六氫β-酸-2,6-二甲基-β-環(huán)糊精（hexahydro-β-acids-2,6-dimethyl-β-cyclodextrin，HHDM-β-CD）、六氫β-酸-β-環(huán)糊精（hexahydro-βacids-β-cyclodextrin，HH-β-CD）、六氫β-酸-α-環(huán)糊精（hexahydro-β-acids-α-cyclodextrin，HH-α-CD）、六氫β-酸-2,3,6-三甲基-β-環(huán)糊精（hexahydro-β-acids-2,3,6-trimethyl-β-cyclodextrin，HH-TM-β-CD）包合物，實驗室自制[7,15-16]；其中各種環(huán)糊精樣品購自山東濱州智源生物科技有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司；鄰二氮菲 天津市天新精細化工開發(fā)中心；30% H2O2新疆潔普樂生物科技有限公司；NaCl、苯甲酸鈉 上海山浦化工有限公司；硫酸亞鐵、檸檬酸 西安化學試劑廠；蔗糖 中國上海試劑一廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、VC、甲醇 天津永晟精細化工有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S型電子天平 德國賽多利斯公司；DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的配制

1.3.1.1 HH甲醇溶液的配制

準確稱取HH 5.00 mg，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL的HH-甲醇溶液，放置4 ℃冰箱中，待用。

1.3.1.2 HH-CD包合物及食品添加劑水溶液的配制

分別準確稱取相應(yīng)質(zhì)量的各種包合物及苯甲酸鈉、VC、NaCl、檸檬酸、蔗糖于100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.12 mg/mL的各種包合物（以包合物中HH質(zhì)量濃度計算）、0.12 mg/mL的苯甲酸鈉、0.10 mg/mL的VC、4.00 mg/mL的NaCl、3.00 mg/mL的檸檬酸、8.00 mg/mL的蔗糖等水溶液。

1.3.1.3 雙組分復配溶液的配制

·OH體系雙組分溶液的配制：將前述質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的HH-M-β-CD、HH-γ-CD、HH-HP-β-CD、HH-TM-β-CD包合物分別和苯甲酸鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為12.00、10.00、8.00、6.00、4.00 μg/mL的系列混合液，分別與0.10 mg/mL的VC、4.00 mg/mL的NaCl、3.00 mg/mL的檸檬酸、8.00 mg/mL的蔗糖溶液按體積比1∶1混合后得到雙組分復配溶液體系。

DPPH自由基體系雙組分溶液的配制：將前述質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的HH-M-β-CD、HH-γ-CD、HHHP-β-CD、HH-TM-β-CD包合物分別和苯甲酸鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為120.00、100.00、80.00、60.00、40.00、20.00 μg/mL的系列混合液，分別與5.00 μg/mL的VC、4.00 mg/mL的NaCl、3.00 mg/mL的檸檬酸、8.00 mg/mL的蔗糖溶液按體積比1∶1混合后得到雙組分復配溶液體系。

1.3.1.4 多組分復配溶液的配制

·OH體系多組分溶液的配制：將前述質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的HH-M-β-CD、HH-γ-CD、HH-HP-β-CD、HH-TM-β-CD包合物溶液配制成質(zhì)量濃度為12.00、10.00、8.00、6.00、4.00 μg/mL的系列溶液，分別與含0.10 mg/mL VC、4.00 mg/mL NaCl、8.00 mg/mL蔗糖混合溶液按體積比1∶1混合后作為多組分復配溶液體系。

DPPH自由基體系多組分溶液的配制：將前述質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的HH-M-β-CD、HH-γ-CD、HHHP-β-CD、HH-TM-β-CD包合物溶液配制成質(zhì)量濃度為120.00、100.00、80.00、60.00、40.00、20.00 μg/mL的系列溶液，分別與含5.00 μg/mL VC、4.00 mg/mL NaCl、3.00 mg/mL檸檬酸混合溶液按體積比1∶1混合后作為多組分復配溶液體系。

1.3.2 ·OH體系抗氧化能力的評價

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[17]。取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中，依次加入pH 7.4、0.20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液2 mL、樣品液1 mL，充分混勻，再加0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL、體積分數(shù)0.01% H2O2溶液1 mL，混勻后，37 ℃下溫育1 h，于536 nm波長處測其吸光度，記為AS；AP為1 mL樣品液用1 mL蒸餾水替代時測得的吸光度；AB為1 mL樣品液和1 mL的H2O2用2 mL蒸餾水替代時測得的吸光度。測試樣品對·OH的清除率（experimental scavenging capacity，ESC）計算如式（1）。

1.3.3 DPPH自由基體系抗氧化能力的評價

DPPH自由基清除實驗參照文獻[18]完成。取不同樣品液1 mL于試管中，加入0.04 mg/mL DPPH溶液3 mL，充分混勻，避光靜置40 min后，測定其在517 nm波長處的吸光度，記為A樣。以1 mL甲醇代替樣品液作空白對照，記為A控；為減少測試誤差，所有測試均采用1 mL樣品液加3 mL甲醇作參比，記為A0。測試樣品對DPPH自由基清除率計算如式（2）。

1.3.4 抗氧化協(xié)同系數(shù)的計算

抗氧化協(xié)同系數(shù)（synergistic effect，SE）為各體系實驗得到的清除率ESC和理論計算的清除率（theoretical scavenging capacity，TSC）之間的比值[19]，即SE＝ESC/TSC。當SE＞1表示有協(xié)同作用；SE＜1表示無協(xié)同作用。

因測試體系的樣品組成不同，理論清除率的計算如式（3）[20]。

式中：ESC1，...，ESCn分別是單一樣品的實驗清除率/%；n代表體系中組分數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)的處理及統(tǒng)計分析結(jié)果均采用Microsoft Excel 2007或Origin Pro8.6軟件處理，實驗數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示（n≥3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除·OH的抗氧化活性評價

2.1.1 HH-CD包合物、食品添加劑單組分體系清除·OH的能力

圖1 ·OH體系中HH-CD包合物的清除率曲線Fig. 1 Hydroxyl radical scavenging effect of hexahydro-β-acidcyclodextrin inclusion complexes

一些抗氧化物質(zhì)主要通過自身的氧化還原反應(yīng)來抑制氧化作用，如含有酚羥基、烯醇鍵類物質(zhì)[21-22]。由實驗可知，未包合的7 種CD均無清除·OH的活性，因此在圖1中未顯示，而所有包合物具有明顯的清除·OH的作用，且清除率都高于同質(zhì)量濃度下的HH甲醇溶液，并隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加；當陽性對照BHT質(zhì)量濃度為60 μg/mL時，其清除率低于10 μg/mL的HH甲醇溶液以及包合物溶液，由此可以說明包合物具有較好的抗氧化活性。分析原因可能是CD包合HH后，HH的烯醇鍵裸露在包合物外面，從而在一定程度上提高了抗氧化的能力。在6.00～10.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HH-β-CD、HH-α-CD和HH-DM-β-CD包合物盡管也有較高的清除率，但因其溶解度較差，使用上可能會存在一定的局限，而HH-M-β-CD、HH-γ-CD、HH-HP-β-CD、HH-TM-β-CD包合物抗氧化或水溶性均較好，有望應(yīng)用于更多的食品體系，因此后續(xù)的實驗考察上述4 種CD包合物與食品添加劑的協(xié)同作用。食品添加劑均參考GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[23]中果蔬汁類飲料標準添加。表1為單一食品添加劑溶液以及不同質(zhì)量濃度苯甲酸鈉溶液對·OH的清除率。

表1 苯甲酸鈉與食品添加劑在·OH體系的清除率Table 1 Hydroxyl radical scavenging effect of sodium benzoate and food additives

2.1.2 雙組分復配體系清除·OH的抗氧化活性

圖2 HH-CD包合物、苯甲酸鈉與食品添加劑雙組分復配體系對·OH清除率的影響Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging effect of binary combinations of hexahydro-β-acid-cyclodextrin inclusion complexes, sodium benzoate and food additives

由圖2可知，隨著包合物質(zhì)量濃度的增加，復配液清除·OH的能力也逐漸增加，其中在質(zhì)量濃度為5.00 μg/mL時HH-HP-β-CD包合物與NaCl的復配液和HH-γ-CD包合物與蔗糖的復配液對·OH清除率呈現(xiàn)下降趨勢，具體原因尚需更深入的研究探明；而隨苯甲酸鈉質(zhì)量濃度的增加，其復配液的清除率遠遠低于包合物的復配液，且增長幅度不顯著，并也在質(zhì)量濃度增加時出現(xiàn)了下降趨勢。在雙組分復配體系中，食品添加劑檸檬酸與包合物復配呈現(xiàn)促氧化作用（其清除率均為負值），可能是檸檬酸中多羥基結(jié)構(gòu)可以螯合Fenten反應(yīng)體系產(chǎn)生的Fe3+所致，但隨包合物質(zhì)量濃度的增加，對氧化反應(yīng)的抑制作用也在不斷增強，說明包合物的加入抑制了檸檬酸促氧化反應(yīng)。

2.1.3 多組分復配溶液清除·OH的抗氧化活性

鑒于在雙組分復配體系中包合物與VC、NaCl、蔗糖之間均具有協(xié)同增效作用，且在實際應(yīng)用中，通常為多種食品添加劑混合添加。因此后續(xù)又考察了包合物與VC-NaCl-蔗糖混合溶液多組分復配體系的協(xié)同抗氧化活性。圖3為多組分復配體系清除·OH的清除率曲線。

圖3 HH-CD包合物與0.05 mg/mL VC-2.00 mg/mL NaCl-4.00 mg/mL蔗糖溶液多組分復配體系對·OH清除率的影響Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging effect of hexahydro-β-acidcyclodextrin inclusion complexes in 0.05 mg/mL vitamin C-2.00 mg/mL sodium chloride-4.00 mg/mL sucrose solution

由圖3可知，復配液清除·OH能力隨包合物質(zhì)量濃度的增加而增加，HH-M-β-CD包合物復配液的清除率明顯高于含有其他包合物的復配液，說明HH-M-β-CD包合物的復配液具有較好的抗氧化活性?？傮w上來看，多組分復配體系的清除活性要弱于雙組分復配體系，說明隨著體系組分的增加，包合物對·OH的清除活性呈現(xiàn)下降的趨勢。

2.2 清除DPPH自由基的抗氧化活性評價

2.2.1 HH-CD包合物、食品添加劑單組分體系清除DPPH自由基的活性

圖4 DPPH自由基體系中HH-CD包合物的清除率曲線Fig. 4 DPPH radical scavenging effect of hexahydro-β-acidcyclodextrin inclusion complexes

因?qū)嶒灉y得未包合的7 種CD和HH-α-CD包合物均無清除DPPH自由基的活性，因此圖4中僅有6 種CD包合物和HH甲醇溶液清除DPPH自由基的清除曲線。結(jié)果表明，HH對DPPH自由基的清除能力要明顯小于對·OH的清除能力。當溶液質(zhì)量濃度為100.00 μg/mL時，HH甲醇溶液清除DPPH自由基的清除率為36.85%，據(jù)相關(guān)文獻可知，啤酒花中的另一個重要活性成分——黃腐酚在質(zhì)量濃度為500.00 μg/mL時，清除率為僅為39.13%[24]，說明HH甲醇溶液清除DPPH自由基的活性高于黃腐酚。HH-TM-β-CD、HH-HP-β-CD、HH-M-β-CD、HHDM-β-CD包合物隨質(zhì)量濃度的增加，抗氧化活性不斷增強，其清除率遠遠高于質(zhì)量濃度為100.00 μg/mL時陽性對照品BHT溶液；且均高于HH甲醇溶液，其可能原因是HH中的羥基與CD分子中的羥基群相互作用，從而增強了包合物的抗氧化能力[25]；由此說明，CD包合作用不僅改善了HH的溶解性，并且在一定程度上提高了其抗氧化活性。

由于VC清除DPPH自由基的活性遠遠強于清除·OH的活性，考慮到在復配體系中VC的抗氧化活性不能太強，因此，選擇VC的質(zhì)量濃度為·OH體系的1/20。表2為單一食品添加劑溶液以及不同質(zhì)量濃度苯甲酸鈉溶液的清除率。

表2 苯甲酸鈉與食品添加劑在DPPH自由基體系的清除率Table 2 DPPH radical scavenging effect of sodium benzoate and food additives

2.2.2 雙組分復配體系清除DPPH自由基的抗氧化活性

由圖5可知，加入VC、NaCl、檸檬酸、蔗糖后，所有復配體系均有清除DPPH自由基的作用，且清除率與各自的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，但當質(zhì)量濃度達到一定值后，其清除率接近平緩趨勢；其中，HH-TM-β-CD包合物與4 種添加劑兩兩復配后的清除率最高，HH-M-β-CD包合物次之。而苯甲酸鈉與食品添加劑的復配體系基本沒有對DPPH自由基的清除活性，且不隨其質(zhì)量濃度的增加發(fā)生改變，與其單組分體系的測定結(jié)果一致。

圖5 HH-CD包合物、苯甲酸鈉與食品添加劑雙組分復配體系對DPPH自由基清除率的影響Fig. 5 DPPH radical scavenging effect of binary combinations of hexahydro-β-acid-cyclodextrin inclusion complexes and sodium benzoate with food additives

2.2.3 多組分復配體系清除DPPH自由基的抗氧化活性

雙組分復配體系中包合物與VC、NaCl、檸檬酸之間具有較好的協(xié)同增效作用，因此有必要考察包合物與VC-NaCl-檸檬酸混合溶液之間的協(xié)同抗氧化作用。圖6為多組分復配體系清除DPPH自由基的曲線圖。

圖6 HH-CD包合物與2.50 μg/mL VC-2.00 mg/mL NaCl-1.50 mg/mL檸檬酸溶液多組分復配體系對DPPH自由基清除率的影響Fig. 6 DPPH radical scavenging effect of hexahydro-β-acid-cyclodextrin inclusion complexes in 2.50 μg/mL vitamin C-2.00 mg/mL sodium chloride-1.50 mg/mL citric acid solution

由圖6可知，4 種包合物復配體系的清除率均隨包合物質(zhì)量濃度的增加而增加，其中含HH-M-β-CD包合物的復配液的清除率最高。在10～60 μg/mL的線性范圍內(nèi)，其對應(yīng)的F值分別為133.59、69.62、88.88、25.93、275.37、198.83（F＞＞F0.01（3,8）＝7.59，記為??），可以得出當質(zhì)量濃度大于40.00 μg/mL時，復配液清除DPPH自由基能力的組間差異較質(zhì)量濃度小于40.00 μg/mL時顯著。

2.3 抗氧化協(xié)同系數(shù)的計算

2.3.1 雙組分復配體系協(xié)同系數(shù)的計算

為計算兩個或兩個以上的組分是否具有抗氧化的協(xié)同作用，可用協(xié)同系數(shù)來衡量復合體系協(xié)同增效作用的大小。表3為雙組分復配體系的協(xié)同系數(shù)。

表3 雙組分復配體系的協(xié)同系數(shù)Table 3 Synergistic effect (SE) of binary combinations

數(shù)據(jù)表明，在·OH體系中，4 種包合物與檸檬酸溶液復配后的協(xié)同系數(shù)均小于1，表現(xiàn)出無協(xié)同增效作用；與VC、NaCl、蔗糖復配后的協(xié)同系數(shù)均大于1，即包合物與VC、NaCl、蔗糖均具有一定的協(xié)同增效作用。這可能是因為VC具有較強的還原性，可還原被氧化的HH，增加其在體系內(nèi)的有效濃度；中性鹽NaCl中和了包合物表面的大量電荷，使水化膜破壞，有助于HH暴露出供氫體或供質(zhì)子體，從而使其抗氧化活性增強[26]；蔗糖含有較多的羥基，可與HH中烯醇鍵上的羥基形成分子間氫鍵，使得烯醇鍵上的羥基更容易脫氫，進而起到了協(xié)同抗氧化的作用[27-28]。

在DPPH自由基體系中，4 種包合物與檸檬酸溶液之間的協(xié)同系數(shù)均大于1，說明包合物與檸檬酸之間具有協(xié)同增效作用；其中HH-M-β-CD和HH-γ-CD在高質(zhì)量濃度時的協(xié)同作用較強，其原因可能是檸檬酸的加入，其分子中多羥基結(jié)構(gòu)不但有利于抗氧化劑的穩(wěn)定，而且可以螯合助氧化作用的金屬離子，因而表現(xiàn)出協(xié)同增效的作用[29]。HH-TM-β-CD、HH-M-β-CD包合物與VC之間都有較好的協(xié)同抗氧化性，但隨質(zhì)量濃度的增加，協(xié)同增效作用有減小的趨勢；而HH-γ-CD包合物僅在10.00～30.00 μg/mL之間與VC有協(xié)同抗氧化性，HH-HP-β-CD包合物與VC無協(xié)同增效作用。在與NaCl復配時，僅有HH-TM-β-CD包合物與NaCl存在協(xié)同抗氧化作用。

在·OH和DPPH自由基體系，苯甲酸鈉與食品添加劑復配液的協(xié)同系數(shù)均小于1，表明它們之間無協(xié)同增效的作用。

2.3.2 多組分復配體系的協(xié)同系數(shù)

表4 多組分復配體系的協(xié)同系數(shù)Table 4 Synergistic effect of quaternary combinations

由表4可知，在·OH體系中，復配液的協(xié)同系數(shù)都小于1；在DPPH自由基體系中，復配液的協(xié)同系數(shù)均大于1，說明復配液在·OH體系中無協(xié)同增效作用，而在DPPH自由基體系具有較好的協(xié)同增效作用。其原因可能是在DPPH自由基體系中，檸檬酸與VC共同使用時，檸檬酸可與VC被氧化后的自由基作用，使抗氧化劑VC獲得再生，從而表現(xiàn)出協(xié)同增效的作用[30]。其中，HH-γ-CD包合物表現(xiàn)清除DPPH自由基的協(xié)同作用最強，HH-M-β-CD次之。

3 結(jié) 論

啤酒花中重要樹脂成分β-酸的氫化衍生物HH自身具有特殊的共軛烯醇式結(jié)構(gòu)，有著較好的抗氧化活性。經(jīng)7 種CD包合后，除α-CD包合物無清除DPPH自由基的活性外，其余所有HH的CD包合物都表現(xiàn)出了比其自身更強的清除·OH和DPPH自由基的活性，并且增加了其水溶性；其中，HH-M-β-CD、HH-γ-CD、HHHP-β-CD、HH-TM-β-CD包合物的效果尤為顯著。上述4 種HH-CD包合物與常用食品添加劑VC、NaCl、蔗糖、檸檬酸所形成的雙組分復配體系在不同程度上均表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化作用，而多組分體系僅表現(xiàn)出清除DPPH自由基的協(xié)同抗氧化性；對照品苯甲酸鈉與4 種食品添加劑組成的雙組分體系均無協(xié)同抗氧化作用。啤酒花應(yīng)用具有非常悠久的歷史，其安全性已在長期的使用中得以證實，上述研究可為天然來源的HH作為功能性食品抑菌防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用提供理論參考，也為拓寬啤酒花的應(yīng)用領(lǐng)域提供了參考。

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