石長春，肖建明，戚建華，高 榮，李 劍

(1.陜西省治沙研究所，陜西 榆林 719000；2.陜西榆林毛烏素沙地荒漠生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測(cè)研究站，陜西 榆林 719000；3.榆林市林業(yè)科學(xué)研究所，陜西 榆林 719000；4.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224)

色澤是食品的重要屬性，是其品質(zhì)的外在特征，生產(chǎn)中往往需要通過添加色素來補(bǔ)正食品的色調(diào)。食用色素可分為天然色素和合成色素兩大類。與人工合成色素相比，天然色素安全性相對(duì)較高，且有些天然色素還具有一些保健功能。近年來人們更加崇尚天然，目前世界天然色素市場正在以2倍于人工合成色素的速度快速增長，市場前景廣闊[1]。黑色素(melanin)是一類普遍存在于生物界結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素的總稱[2]。這類天然色素可以作為抗氧化劑，具有抗輻射[3]、光保護(hù)[4]、金屬螯合[5]、抗氧化[6]、免疫促進(jìn)[7]、抗蛇毒[8]、抗癌[9]等。

文冠果(Xanthocerassorbifolia)是我國特產(chǎn)的油料樹種和園林綠化樹種，適應(yīng)性強(qiáng)，被我國政府確定為重點(diǎn)發(fā)展的生物能源樹種，在北方干旱半干旱地區(qū)大面積栽培[10-12]。其種仁榨油用作生物柴油的生產(chǎn)原料，其黑色的種皮約占種子質(zhì)量的50%，目前尚未被有效開發(fā)利用。

本研究以文冠果種皮為原料提取黑色素，研究該黑色素對(duì)pH、蔗糖、溫度、光照、還原劑、氧化劑和金屬離子的穩(wěn)定性及其抗氧化活性，以期為文冠果種皮黑色素的開發(fā)利用供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

文冠果種子采自榆林市林業(yè)科學(xué)研究所，帶回實(shí)驗(yàn)室后手工剝?nèi)》N皮，粉碎后過0.25 mm篩備用。二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)購自Sigma公司(美國)，其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 文冠果種皮黑色素的提取與精制

黑色素的提取參照姚增玉[13]等的方法，并略有改進(jìn)。稱取50 g文冠果種皮放入錐形瓶中，加入1 000 mL去離子水煮沸15 min后過濾，向?yàn)V渣中加入0.5 mol/L NaOH溶液750 mL，置于60℃水浴中提取24 h。提出液用棉布粗慮后以10 000 RPM離心10 min。收集上清液并以HCl酸化至pH 2，靜置12 h后離心取沉淀。將得到的黑色素粗提物沉淀用7 mol/L HCl于100℃下水解2 h，離心并依次用純水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌所得沉淀，真空干燥后得到顆粒狀黑色素。

1.3 文冠果種皮黑色素溶液的配制

將100 mg文冠果種皮黑色素用10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% 的氨水在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶解，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓抽去多余氨氣，直至pH 值達(dá)7.5，最后用去離子水稀釋至所需濃度。

1.4 文冠果種皮黑色素的穩(wěn)定性測(cè)試

1.4.1 對(duì)pH的穩(wěn)定性 將文冠果種皮黑色素溶液用NaOH或HCl調(diào)至不同的pH值，測(cè)定400 nm處的吸光度。

1.4.2 對(duì)蔗糖的穩(wěn)定性 4.5 mL 100 mg/L的文冠果種皮黑色素溶液與0.5 mL不同濃度的蔗糖溶液混合(混合液中蔗糖濃度分別為0.01、0.1 mg/L和1 mg/L)，在室溫下放置12 h后測(cè)定400 nm處的吸光度。

1.4.3 對(duì)溫度的穩(wěn)定性 在9支15 mL具塞試管中各加入5 mL濃度為100 mg/L的文冠果種皮黑色素溶液，加蓋后分為3組，分別置于25、60℃和100℃水浴中。分別于0.5、1.5 h和3 h從每個(gè)水浴鍋中取出1支試管立即用自來水冷卻，測(cè)定400 nm處吸光度。

1.4.4 對(duì)紫外光的穩(wěn)定性 取20 mL濃度為100 mg/L文冠果種皮黑色素溶液于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，敞口置于距紫外燈管30 cm處進(jìn)行照射，分別于0、0.5、1.5、3.5 h取出2 mL在400 nm波長下測(cè)其吸光度。

1.4.5 對(duì)自然光的穩(wěn)定性 在2支具塞三角瓶中各加入50 mL濃度為100 mg/L的文冠果種皮黑色素溶液，加塞后將其中一支用黑布包裹，然后將它們同時(shí)置于室內(nèi)自然光下，分別于5、10、15、30 d各取出2 mL在400 nm波長下測(cè)其吸光度。

1.4.6 對(duì)還原劑的穩(wěn)定性 將4.5 mL濃度為100 mg/L的文冠果種皮黑色素溶液與0.5 mL不同濃度的Na2S2O3混合(混合液中Na2S2O3的濃度分別為0.01、0.1 mg/L和1 mg/L)，在室溫下放置12 h后測(cè)定400 nm處的吸光度。

1.4.7 對(duì)氧化劑的穩(wěn)定性 同1.4.6，惟其以H2O2代替Na2S2O3。

1.4.8 對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性 以金屬的鹽酸鹽配制濃度為0.1、1 mmol/L和10 mmol/L的Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+溶液。將4.5 mL濃度為100 mg/L的文冠果種皮黑色素溶液與0.5 mL金屬離子溶液混合后在室溫下放置12 h，觀察是否產(chǎn)生沉淀，若未形成沉淀，則測(cè)定溶液400 nm處的吸光度。

1.5 文冠果種皮黑色素抗氧化活性測(cè)試

1.5.1 總抗氧化活性 總抗氧化活性采用β-胡蘿卜素—亞油酸乳化液模型進(jìn)行分析，方法參考Pratt[14]等的文獻(xiàn)并略有改動(dòng)。1 mL β-胡蘿卜素的氯仿溶液(5.2 mg/mL)與40 mg亞油酸以及400 mg吐溫20混合于燒瓶中，于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，然后緩慢加入100 mL超純水并劇烈搖動(dòng)制成乳化液。對(duì)照不加β-胡蘿卜素溶液，其他同前。

在各試管中加入5 mL β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液和1 mL不同濃度的試樣，搖勻后立即測(cè)定470 nm處的吸光度，作為0時(shí)刻的吸光度，然后將試管置于50℃水浴鍋中溫育1 h后再次測(cè)定吸光度。用于儀器調(diào)零的乳化液由5 mL不含β-胡蘿卜素的乳化液和1 mL超純水組成。

(1)

1.5.2 清除羥自由基(·OH)活性的測(cè)定 采用鄰二氮菲—Fe2+氧化法測(cè)定[15]。1)依次向試管中加入0.75 mol/L鄰二氮菲溶液1 mL，0.2 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液2 mL和超純水1 mL，搖勻后加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻并加人0.01% H2O21 mL，37℃下反應(yīng)60 min，測(cè)定536 nm處吸光度，其值稱Af。2)用超純水代替H2O2，其他同1)，其吸光度稱A0。3)用試樣代替1)中的超純水，其吸光度稱Ax。4)用試樣代替1)中的H2O2，測(cè)得的吸光度稱As。

·OH 清除率=100-(As-Ax)/(A0-Af)×100%

(2)

1.5.3 清除DPPH·活性的測(cè)定 參照Sanchez-Moreno[16]的方法。0.2 mL試樣與5 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH·甲醇溶液混合，于室溫下遮光放置30 min，測(cè)定其517 nm處的吸光度值(A)；以雙蒸水代替樣品為空白對(duì)照(A0)；以0.2 mL樣品與5 mL甲醇混合液為樣品本底吸收校正(Aj)；以甲醇調(diào)儀器零點(diǎn)。

DPPH·清除率=100-(A-Aj)/A0×100%

(3)

1.5.4 還原力的測(cè)定 參照M.Oyaizu[17]的方法測(cè)定。取0.25 mL不同濃度(20～500 μg/mL)的試樣溶液，再加入200 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和濃度為1% 的K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL，混合均勻后置于50℃水浴反應(yīng)20 min。取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸混勻，然后以650×g相對(duì)離心力離心10 min。取上層溶液5.0 mL加入蒸餾水5.0 mL，0.1% FeCl31.0 mL，測(cè)定700 nm處吸光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

每一個(gè)處理獨(dú)立重復(fù)3次，文中數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果種皮黑色素的穩(wěn)定性

2.1.1 pH和蔗糖對(duì)文冠果種皮黑色素的影響 文冠果種皮黑色素在pH<4時(shí)發(fā)生部分沉淀，其溶液的顏色隨著pH值的增大而逐漸加深，從淺紅棕色逐漸變?yōu)榧t褐色。黑色素在可見光區(qū)沒有吸收峰，是一條隨波長增加而吸光度減小的曲線[18-19]?？煽缮氐淖贤饪梢姽夤庾V亦是如此，國家標(biāo)準(zhǔn)中以400 nm作為測(cè)定可可色素色價(jià)的波長[20]，因此本研究以400 nm處的吸光度作為評(píng)價(jià)文冠果種皮黑色素穩(wěn)定性的指標(biāo)。從圖1A同樣可以看出，400 nm處的吸光度進(jìn)一步證實(shí)了文冠果種皮黑色素溶液的顏色隨著pH增加而加深，類似現(xiàn)象在山杏種皮黑色素的研究中也有報(bào)道[19]，這種顏色的變化被認(rèn)為是由于黑色素中存在的羧基、酚羥基等酸性官能團(tuán)的質(zhì)子化—解離而引起的。

文冠果種皮黑色素溶液中加入蔗糖前后的400 nm處吸光度如圖1B所示。從圖中可以看出，加入蔗糖前后色素溶液的吸光度沒有明顯變化，說明文冠果種皮黑色素對(duì)蔗糖穩(wěn)定。

圖1 溶液pH(A)和蔗糖(B)對(duì)文冠果種皮黑色素400 nm處吸光度的影響

2.1.2 溫度對(duì)文冠果種皮黑色素的影響 不同溫度下文冠果種皮黑色素溶液在400 nm處的吸光度隨時(shí)間的變化如圖2所示。從圖2可以看出，在室溫下文冠果種皮黑色素保持穩(wěn)定，隨著時(shí)間延長，其吸光度無明顯變化；但加熱可使其吸光度增大，且溫度越高，變幅越大。植物黑色素為酚類聚合物，加熱可能使部分酚羥基氧化成醌基，從而改變了色素的共軛體系，導(dǎo)致顏色加深。

2.1.3 光照對(duì)文冠果種皮黑色素的影響 將文冠果種皮黑色素溶液分別置于黑暗和室內(nèi)自然光下放置，其400 nm處吸光度隨放置天數(shù)的變化如圖3(A)所示。從圖3(A)可以看出，隨著時(shí)間的推移，無論黑暗還是自然光照條件下，溶液吸光度都有所增大，且自然光照條件下增幅更大。從圖3(B)可以看出，在紫外光照射下文冠果種皮黑色素的吸光度增大。說明自然光和紫外光對(duì)文冠果種皮黑色素具有增色作用。

圖2 溫度對(duì)文冠果種皮黑色素400 nm處吸光度的影響

圖3 自然光(A)和紫外線(B)對(duì)文冠果種皮黑色素400 nm吸光度的影響

2.1.4 氧化劑和還原劑對(duì)文冠果種皮黑色素的影響 在文冠果種皮黑色素溶液中加入不同濃度的H2O2或Na2S2O3，其吸光度變化如圖4所示。由圖4可以看出，文冠果種皮黑色素可被H2O2氧化褪色，還原劑Na2S2O3對(duì)色素沒有明顯影響。這可能是因?yàn)楹谏鼐哂幸欢ǖ倪€原性。

2.1.5 金屬離子對(duì)文冠果種皮黑色素的影響 由圖5可以看出，在加入Na+或Mg2+后溶液吸光度沒有顯著變化；低濃度的Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+可使溶液的吸光度增大，而高濃度時(shí)發(fā)生沉淀。說明文冠果種皮黑色素對(duì)Na+和Mg2+穩(wěn)定而對(duì)Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+不穩(wěn)定，這可能是因?yàn)檫@些金屬離子更容易與黑色素中的羥基、羧基等官能團(tuán)絡(luò)合。

圖4 氧化劑和還原劑對(duì)文冠果種皮黑色素400 nm吸光度的影響

2.2 文冠果種皮黑色素的抗氧化活性

2.2.1 文冠果種皮黑色素的總抗氧化活性 β-胡蘿卜素為多烯色素，亞油酸氧化產(chǎn)生的過氧化物能使反應(yīng)體系中的β-胡蘿卜素褪色，隨著時(shí)間的延長吸光度逐漸減小，若在反應(yīng)體系中加入抗氧化劑，則褪色速度減慢，且褪色程度與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。本研究對(duì)文冠果種皮黑色素的抗氧化活性與傳統(tǒng)的人工合成食品抗氧化劑2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)進(jìn)行對(duì)比，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，2種抗氧化劑對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸自氧化體系均有明顯的抑制作用，文冠果種皮黑色素的抑制能力低于BHT。但在試驗(yàn)條件下，2種抗氧化劑在較高濃度(500 μg/mL)均可幾乎完全抑制體系中β-胡蘿卜素的氧化。

圖5 金屬離子對(duì)對(duì)文冠果種皮黑色素400 nm吸光度的影響

圖6 文冠果種皮黑色素在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液系統(tǒng)中的抗氧化效果

2.2.2 文冠果種皮黑色素的清除·OH和DPPH·活性 羥自由基活性強(qiáng)，可與生物體內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)、DNA等多種物質(zhì)反應(yīng)，危害性大。DPPH·是一種比較穩(wěn)定的有機(jī)自由基，對(duì)其的清除性能常被用于評(píng)價(jià)受試物降低多種自由基濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的能力。文冠果種皮黑色素和BHT對(duì)·OH和DPPH·清除效果如圖7所示。從圖7A可以看出，2種抗氧化劑均具有清除·OH的能力。各試驗(yàn)濃度下，文冠果種皮黑色素對(duì)·OH的清除羥率與BHT均無顯著差異。從圖7B可以看出，2種抗氧化劑對(duì)DPPH·的清除能力均具有量效性。高濃度下(500 μg/mL)文冠果種皮黑色素清除DPPH·能力強(qiáng)于BHT。但是作為合成抗氧化劑的BHT設(shè)有使用限量，而天然抗氧化劑則無此限制。

2.2.3 文冠果種皮黑色素的還原力 還原力是物質(zhì)潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)，因此還原力是抗氧化劑性能評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。本研究將文冠果種皮黑色素的還原力與BHT進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如圖8所示，700 nm處的吸光度值越大還原能力越強(qiáng)。從圖8可以看出，文冠果種皮黑色素的還原力高于BHT，在200 μg/mL的濃度下，前者吸光度為1.209，而后者僅為0.475。

圖7 文冠果種皮黑色素清除·OH和DPPH·活性

圖8 文冠果種皮黑色素的還原力

3 結(jié)論與討論

文冠果種皮黑色素在pH<4時(shí)發(fā)生部分沉淀，其溶液的顏色隨著pH值的增大而逐漸加深；加熱和光照線對(duì)文冠果種皮黑色素具有增色效應(yīng)；氧化劑可使文冠果種皮黑色素褪色，而還原劑和蔗糖對(duì)其無顯著影響；該色素對(duì)Al3+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+不穩(wěn)定而對(duì)Na+和Mg2+穩(wěn)定。文冠果種皮黑色素在對(duì)紫外光、自然光、還原劑等的穩(wěn)定性方面與山杏種皮黑色素[9]、桂花種皮黑色素[21]并不一致，反映了它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和類型上的差異。也為根據(jù)加工工藝、包裝、儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件等具體情況選擇合適的黑色素作為著色劑提供了可能。

文冠果種皮黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其對(duì)·OH的清除羥率與BHT相當(dāng)，高濃度下清除DPPH·能力強(qiáng)于BHT，還原能力高于BHT，但總抗氧化能力不及BHT。但山文冠果種皮黑色素兼具著色劑和抗氧化劑的雙重作用，而BHT不具有著色功能；前者為天然產(chǎn)物，更易被受消費(fèi)者接受。

植物黑色素不僅可以作為食品色素和抗氧化劑，還具有保健和治療疾病的功能，諸如抗癌[22]、抗蛇毒[23]、免疫促進(jìn)[24]、抗HIV[17]和治療帕金森癥[25]等，因而這類天然色素受到越來越多的研究人員關(guān)注，黑色食品也因其滋補(bǔ)、養(yǎng)生、抗衰老等方面的功效而引起人們濃厚的興趣。此外，文冠果種皮為林產(chǎn)加工剩余物，資源豐富，廉價(jià)易得，具有可再生性。因此，文冠果種皮黑色素是一種兼具抗氧化功能甚至其他保健功能的著色劑資源，可資進(jìn)一步開發(fā)利用。

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