王曉丹，白曉燕，朱國軍，雷安亮，陳美竹，邱樹毅*

（1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州 遵義 563000）

絕大多數(shù)白酒均呈甜味，甜味是一種讓人感覺比較愉悅的口感，尤其在酒精度高的白酒中，微甜味可以使酒體更加綿柔醇厚。這種甜味主要來自于醇類[1]。多元醇是酒醅中的酵母菌在生成酒精的同時通過發(fā)酵還原糖所產(chǎn)生的，在酒中可起緩沖作用，使白酒更加豐滿醇厚[1-2]。白酒中的多元醇種類繁多，主要包括丙三醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、麥芽糖醇等，甜度隨羥基數(shù)增多而增強[2]。由于多元醇沸點高，屬于難揮發(fā)性醇類，不易隨蒸餾進入酒中，在蒸餾酒醅時，一小部分多元醇會隨著水蒸氣被帶入酒中，因此白酒中多元醇含量極低，定量分析的難度較大[3]。

目前，白酒中多元醇的檢測方法主要有：薄層層析法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatography-evaporativelight-scattering detector，HPLCELSD）[4]、液質聯(lián)用法[5]、毛細管氣相色譜法[6]、離子色譜積分脈沖安培法[7-8]等。氣相色譜法由于其高分辨率、高靈敏度、低檢測限等優(yōu)點而被廣泛使用。但多元醇具有高極性、強親水性以及低揮發(fā)性的特性，氣相色譜法測定時，必須將糖醇衍生化為易揮發(fā)且穩(wěn)定的衍生物，操作繁瑣而復雜，容易帶來誤差[9]。離子色譜法雖然靈敏度較好，但是受環(huán)境溫度的影響大，且由于糖類在電極表面能將某些分子氧化或還原，因而該方法準確性受限[10]。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法具有基線穩(wěn)定、分離效果良好，結果準確、樣品處理簡單、測定速度快等優(yōu)點，因此在本研究中選用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法對酵母發(fā)酵液中多元醇進行測定。

由于白酒釀造中，多元醇不易隨蒸餾進入酒中，本研究建立一種高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法對酵母菌發(fā)酵液中多元醇種類及含量進行測定，以課題組前期從醬香型大曲和酒醅中分離的酵母菌株為研究對象，測定酵母菌產(chǎn)多元醇類物質的能力。以期找到在白酒釀造中對多元醇產(chǎn)生能力較強的酵母菌，為后期白酒中多元醇的提高奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）（FBKL2.0118、FBKL2.0307、FBKL2.0315）、婁德酵母（Lodderomyceselongisporus）FBKL2.00130、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）FBKL2.0310分離篩選于醬香型大曲和酒醅中并保藏于貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室。

D-阿拉伯糖醇（純度≥98%）、D-核糖醇（純度≥98%）、赤蘚糖醇（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；木糖醇（純度≥99.5%）、山梨糖醇（純度≥98%）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dxtrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

酵母種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖200 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Academic密理博超純水儀：密理博（上海）貿易有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent G4260B蒸發(fā)光散射檢測器、SPEC18固相萃取小柱（200 mg，3 mL）、Agilent Hi-plexCa液相色譜柱（7.7 mm×300 mm，8μm）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

精確稱取D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨糖醇標準品0.01 g于10 mL容量瓶中，用二次蒸餾水分別配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，并用0.22μm微孔濾膜過濾。準確稱取D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨糖醇標準品各0.500 0 g于50 mL容量瓶中，配制成質量濃度為10.0 mg/mL的多元醇混合標準品儲備溶液，用蒸餾水稀釋成質量濃度分別為8.0 mg/mL、6.0 mg/mL、4.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL的混合標準工作液，并用0.22μm微孔濾膜過濾。

1.3.2 樣品處理

大數(shù)據(jù)常用的數(shù)據(jù)分析處理技術包括云計算和Mapreduce系統(tǒng)、數(shù)據(jù)庫、可視化技術等。云計算是大數(shù)據(jù)分析處理技術的核心原理，也是大數(shù)據(jù)分析應用的基礎平臺。Mapreduce系統(tǒng)提出簡化了數(shù)據(jù)的計算過程，避免了大量數(shù)據(jù)傳輸。數(shù)據(jù)庫則是為用戶提供了各種數(shù)據(jù)以及獲取數(shù)據(jù)的方式，可視化技術即運用計算機圖形學和圖像處理技術，將分析出來的數(shù)據(jù)轉換為圖形或圖像形式，與用戶進行交互處理。這一技術極大地方便了通過數(shù)據(jù)及時掌握生產(chǎn)的內在變化[1]。隨著數(shù)據(jù)處理軟件的不斷更新升級，越來越多的多樣化功能軟件將被應用在工業(yè)生產(chǎn)的大數(shù)據(jù)動態(tài)分析中，自動為用戶展現(xiàn)最直觀的結果。

參照白小燕等[11]的方法，將酵母菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后接種到酵母種子培養(yǎng)基中，在30℃、160 r/min條件下擴大培養(yǎng)24 h即為種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)液按照5%的接種比例接種到裝液量為50 mL/250 mL的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d后獲得發(fā)酵液。

吸取5 mL發(fā)酵液于試管中，65℃水浴10 min后轉移到離心管中，10 000 r/min離心10 min，獲得上清液并經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，再用0.22μm水系濾膜過濾后，待高效液相色譜儀分析。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜條件：Agilent Hi-plexCa色譜柱（7.7 mm×300 mm，8 μm）；流動相：純水；流速：0.5 mL/min；柱溫：70℃；進樣量：4μL；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；霧化溫度為60℃；蒸發(fā)溫度為60℃；增益：2；氮氣（純度為99.999%）為載氣。采用5種多元醇標準品的色譜峰保留時間對發(fā)酵液中多元醇進行定性；用外標法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 5種多元醇標準品及樣品高效液相色譜檢測結果

由圖1可知，HPLC-EISP法可以檢測到酵母發(fā)酵體系中的主要成分葡萄糖和甘油，同時還可以測到D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇這五種多元醇，因此說明此方法能夠準確分析酵母發(fā)酵多元醇的代謝成分的變化。從多元醇標準品得到各多元醇的保留時間為：葡萄糖13.329 min，D-核糖醇16.869 min，赤蘚糖醇19.568 min，甘油20.349，D-阿拉伯糖醇23.143 min；木糖醇28.103 min，山梨醇29.223 min。將酵母發(fā)酵液和多元醇標準品對比可得，酵母FBKL2.0118發(fā)酵液中含有D-核糖醇和D-阿拉伯糖醇；酵母FBKL2.0315發(fā)酵液中含有赤蘚糖醇；酵母FBKL2.0310發(fā)酵液中含有甘油、D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨醇，且由于殘?zhí)橇窟^高，葡萄糖已經(jīng)超出檢測限，出現(xiàn)平頭峰；酵母FBKL2.0073發(fā)酵液中含有D-阿拉伯糖醇；酵母FBKL2.0307發(fā)酵液中含有D-阿拉伯糖醇和山梨醇。進一步優(yōu)化D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇和山梨醇五種多元醇檢測方法。

2.2 回歸方程、線性范圍和檢出限

配制不同質量濃度的5種多元醇混合標準溶液，在相同試驗條件下進行測試分析，根據(jù)測得的峰面積（Y）和相對應的多元醇質量濃度（X）進行線性回歸，得到5種多元醇標準品的線性回歸方程和相關系數(shù)R；以信噪比等于3（S/N=3）為標準[12]，得到5種多元醇的檢出限，結果如表1所示。由表1可知，5種多元醇的相關系數(shù)R在0.996～0.999之間，表明在各自線性范圍內5種多元醇的質量濃度與峰面積均具有良好的線性關系。5種多元醇檢出限在0.045～0.058mg/mL之間，表明該方法能夠實現(xiàn)多元醇含量的測定。

表1 5種多元醇標準品的回歸方程、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equation,linear range and limit of detection of 5 polyhydric alcohols

2.3 精密度實驗

表2 精密度實驗結果Table 2 Results of precision tests

采用HPLC-ELSD法對5種多元醇的混合標準工作溶液（1.0 mg/mL）平行測定6次，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD），判斷該檢測方法的精密度[13-15]，結果如表2所示。由表2可知，5種多元醇含量檢測結果的相對標準偏差（RSD）均在1.22%～4.53%之間，說明該實驗方法精密度良好。

2.4 方法的回收率試驗

用菌株FBKL2.0310制備相同酵母發(fā)酵液2份，其中一份發(fā)酵液作為本底，另一份發(fā)酵液添加一定量的5種多元醇溶液進行加標回收率試驗，設置3個水平，每個水平重復進樣6次，采用HPLC-ELSD法進行檢測，計算回收率和RSD值[16-17]，結果如表3所示。由表3可知，5種多元醇的平均回收率在96.73%～100.46%之間，RSD值為0.22%～3.31%，說明該方法準確度較高，可以用于實際酵母發(fā)酵液的檢測。

表3 樣品加標回收率試驗結果Table 3 Results of samples adding standard recovery rates tests

2.5 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性試驗

取5種多元醇的混合標準工作溶液（1.0 mg/mL），放置于4 ℃冰箱中，分別于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h時取樣，進行多元醇含量測定，測得標品中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的峰面積相對標準偏差（RSD）（n=6）分別為2.28%、1.75%、1.99%、1.88%、2.84%和2.10%。表明該方法對于5種多元醇在24 h內測定穩(wěn)定性較好。

按樣品發(fā)酵液制備方法平行操作，取菌株FBKL2.0310制備的發(fā)酵液6份，平行進樣3次，測得發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的峰面積相對標準偏差（RSD）分別為1.03%、1.36%、0.40%、1.87%和0.37%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.6 酵母菌株發(fā)酵液中多元醇定量分析

本課題組前期從醬香型大曲和酒醅中篩選到利用葡萄糖產(chǎn)生糖醇能力較強的酵母菌株FBKL2.0130、FBKL2.0118、FBKL2.0307、FBKL2.0310、FBKL2.0315，并以這5株酵母菌作為發(fā)酵菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d得到發(fā)酵液，利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法對5株酵母發(fā)酵液中多元醇進行測定，將測得各多元醇峰面積代入相應的回歸方程得到各多元醇的含量，定量結果如表4所示。由表4可知，菌株FBKL2.0130產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力最強（12.05 g/L），并且產(chǎn)多元醇總量最多（13.03 g/L）；菌株FBKL2.0118產(chǎn)D-核糖醇和D-阿拉伯糖醇；菌株FBKL2.0307產(chǎn)D-阿拉伯糖醇和山梨糖醇；菌株FBKL2.0310能夠產(chǎn)D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨糖醇，菌株FBKL2.0315僅可以產(chǎn)赤蘚糖醇。

表4 不同酵母發(fā)酵液中多元醇含量Table 4 Polyhydric alcohols contents in different yeast fermentation broth

3 結論

本實驗建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）同時檢測酵母發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇的方法。結果表明，5種多元醇在0.8～6.0 mg/mL質量濃度范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系（相關系數(shù)R均≥0.996）；精密度實驗結果相對標準偏差（RSD）均＜5%，回收率為96.73%～100.46%，重現(xiàn)性和樣品在24 h內穩(wěn)定性的RSD均＜1.90%，表明該方法具有良好的準確性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。菌株FBKL2.0130產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力最強（12.05g/L）；且產(chǎn)多元醇總量最多（13.03g/L）。

本實驗以醬香型白酒釀造過程中大曲和酒醅分離的酵母為研究對象，運用本方法能夠在30 min內同時測定到酵母發(fā)酵液中的D-阿拉伯糖醇、D-核糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇，為白酒的風格特征的凸顯和品質的保證提供了科學依據(jù)和保證。

參考文獻：

[1]孫 潔，李好轉，孫立臻，等.芝麻香型白酒酒醅中多元醇分析方法探討[J].釀酒科技，2015（6）：51-53.

[2]TAT L,COMUZZOP,STOLFOI,et al.Optimization of wineheadspace analysisby solid-phasemicroextractioncapillary gaschromatography with massspectrometric and flameionization detection[J].Food Chem,2005,93(2)：361-369.

[3]韓興林，王 勇，魏金旺，等.清香型白酒中多元醇含量的分析研究[J].釀酒科技，2013（8）：44-49.

[4]YUEJ,NARINESS.Separation and quantification of vegetableoil based polyols by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection[J].J Am Oil Chem Soc,2007,84(9)：803-807.

[5]WAMELINK M M C,SMITHD EC,JAKOBSC,et al.Analysis of polyolsin urine by liquid chromatography-tandem massspectrometry：A useful tool for recognition of inborn errors affecting polyol metabolism[J].J Inherit Metab Dis,2005,28(6)：951-963.

[6]SHETTY H U,HOLLOWAY H W,RAPOPORT SI.Capillary gas chromatography combined with ion trap detection for quantitativeprofiling of polyols in cerebrospinal fluid and plasma[J].Anal Biochem,1995,224(1)：279-285.

[7]宋林林，李 凈，譚光迅，等.枝江白酒含氮化合物和多元醇的定量分析[J].釀酒，2015，42（3）：42-45.

[8]GE SL,WANG H,WANG Z F,et al.Sensitive measurement of polyols in urineby capillary zone electrophoresiscoupled with amperometric detection using on-column complexation with borate[J].J Chromatogr B,2013,915-916：39-45.

[9]MEDEIROSP,SIMONEIT B.Analysis of sugars in environmental samplesby gaschromatography-massspectrometry[J].J Chromatogr A,2007,1141(2)：271-278.

[10]費 棟，陳梅蘭，朱 巖.離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法測定食品中糖[J].理化檢驗：化學分冊，2010，46（1）：76-78.

[11]白小燕，邱樹毅，雷安亮，等.醬香白酒釀造過程中產(chǎn)多元醇功能酵母的篩選[J].中國釀造，2017，36（5）：58-62.

[12]朱群英，江 勇，甘 鈺.HPLC-ELSD法同時測定食品中5種糖[J].食品科學，2008，29（12）：503-506.

[13]PORTER L,HRSTICH L,CHAN B.The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyaniding and delphinidin[J].Phytochemistry,1985,25(1)：223-230.

[14]張麗麗.高產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株的篩選及其發(fā)酵條件的研究[D].無錫：江南大學，2009.

[15]王鳳偉.耐高滲赤蘚糖醇生產(chǎn)菌的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化[D].無錫：江南大學，2012.

[16]楊其義.木糖醇生產(chǎn)菌株的篩選及工藝優(yōu)化[D].濟南：齊魯工業(yè)大學，2013.

[17]齊向輝，王 旭，林 靜，等.耐高糖酵母的篩選鑒定及其產(chǎn)多元醇分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（10）：16-21.