廖建春 劉麗君 王錢道

（揚州市中醫(yī)院，江蘇揚州225000）

近年來，不孕不育癥發(fā)病逐年上升。有資料表明，男方生殖功能異常引起不孕不育可能占40%～50%[1]，其中男性不育的主要原因可能是精子數(shù)量少、質(zhì)量低，但發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床也缺乏特別有效的治療藥物[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗方、淫羊藿和仙茅有抗氧化效應(yīng)，可提高血清總超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低丙二醛（MDA），清除氧自由基和保護細胞免受損傷，從而影響精子運動功能[3-5]。五子衍宗方、淫羊藿苷可通過影響精漿中性α-葡糖苷酶或果糖從而影響精子活力和精子成熟度[6-7]。加味五子衍宗合劑是在五子衍宗方基礎(chǔ)上加淫羊藿、仙茅等，多年來用于臨床精液異常男性不育癥，療效顯著。本課題組同期研究發(fā)現(xiàn)，加味五子衍宗合劑及其組分中藥能夠改善生精細胞損傷模型大鼠血清睪酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）等生殖激素水平，從而提高睪丸生精作用。本研究旨在通過測定附睪勻漿組織中α-葡糖苷酶、果糖含量，睪丸、附睪勻漿組織中MDA、SOD含量，進一步探討加味五子衍宗合劑及其組分中藥對腺嘌呤所致生精細胞損傷模型大鼠的可能治療機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠80只，260～280g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 實驗藥物 加味五子衍宗合劑，藥物組成：枸杞子12g，菟絲子12g，覆盆子12g，五味子3g，車前子6g，淫羊藿12g，仙茅6g，茯苓9g，肉蓯蓉6g，巴戟天6g，制何首烏6g，當(dāng)歸6g，牛膝6g。五子衍宗方，藥物組成：枸杞子12g，菟絲子12g，覆盆子12g，五味子3g，車前子6g。仙茅+淫羊藿藥物組由仙茅6g、淫羊藿12g組成。仙茅組藥物為仙茅6g，淫羊藿組藥物為淫羊藿12g。枸杞子、覆盆子、當(dāng)歸、五味子、車前子、淫羊藿、仙茅、茯苓購自安徽惠隆中藥飲片有限公司，菟絲子、肉蓯蓉、巴戟天、制何首烏、牛膝購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，均為符合藥典規(guī)定之正品。由揚州市中醫(yī)院制劑室制備各組水提物。準確稱取各藥材，其中車前子布包，各藥材加水提取2次，第1次加8倍量的水，浸泡0.5h，煎煮1h，濾過，第2次加6倍量的水，煎煮1h，濾過。合并2次濾液，常壓濃縮至80℃下相對密度不低于1.04，常溫下靜置12h以上，將藥液通過直管離心機，以16000r/min的速度離心，澄清液繼續(xù)濃縮至80℃下相對密度不低于1.07，滅菌，分裝，250mL/瓶。加味五子衍宗合劑、五子衍宗方、仙茅+淫羊藿水提物、仙茅水提物、淫羊藿水提物濃度分別為432mg/mL、180mg/mL、72mg/mL、24mg/mL、48mg/mL。

1.3 試劑 腺嘌呤：Sigma，批號WXBB0585V；果糖ELISA試劑盒、α-葡糖苷酶：上海源葉生物科技有限公司，批號分別為16042705、16042706；MDA測試盒、SOD測試盒：南京建成生物工程研究所，批號分別為20100503、20100503。

1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀，Multiskan MK3，Thermo Fisher Scientific；組織勻漿器，D-160手持式，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；分析天平，BSA124S，塞多利斯科儀器（北京）有限公司；低速臺式離心機，MicroCL 17R，Thermo Fisher Scientific；水浴鍋，HW-5L，鄭州博科儀器設(shè)備有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 造模大鼠使用由腺嘌呤配成的濃度為14mg/mL的混懸液按20mg/100g體重灌胃，1次/d，連續(xù)4周，以出現(xiàn)大鼠體重減少、倦臥少動、怕冷、豎毛且毛枯無光澤、弓背蜷縮、少食多飲、小便量多等為造模成功指標(biāo)[8-10]。選正常大鼠10只作為正常組，造模成功的大鼠60只按隨機數(shù)目表法分為模型組、五子衍宗合劑組、五子衍宗方組、仙茅+淫羊藿水提物組、仙茅水提物組、淫羊藿水提物組，每組10只。

2.2 給藥 造模成功后，除正常組、模型組給予生理鹽水6mL/kg體重灌胃，各給藥組按照藥理學(xué)動物與人體間等效劑量換算，按6mL/kg體重給予相應(yīng)的藥物灌胃，每日1次，連續(xù)6周。

2.3 檢測指標(biāo) 末次給藥后頸椎脫臼處死大鼠，取睪丸和附睪組織，用4℃ 0.9%氯化鈉注射液在冰水浴中制成5%的組織勻漿，將勻漿3000r/min（4℃）離心10min，取各組大鼠睪丸和附睪勻漿上清液進行檢測。按試劑盒說明書檢測附睪組織中α-葡糖苷酶、果糖含量，睪丸、附睪組織中MDA、SOD含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間樣本均數(shù)采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較采用 t 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠附睪組織中α-葡糖苷酶、果糖含量比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠附睪組織中α-葡糖苷酶、果糖含量比較（ ±s）

表1 各組大鼠附睪組織中α-葡糖苷酶、果糖含量比較（ ±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01 ；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與加味五子衍宗合劑組比較，△P＜0.05。

組別　　動物數(shù)（只）α-葡糖苷酶（U/mL）果糖（mg/mL）正常組　10　10.81±3.60　95.88±10.28模型組　10　5.16±1.39**　89.1042±7.31加味五子衍宗合劑組　10　7.14±1.40##　109.12±13.97##五子衍宗方組　10　6.78±0.89##　99.13±20.36△仙茅+淫羊藿水提物組　10　7.30±0.86##　113.11±28.51#仙茅水提物組　10　6.18±0.42#　103.63±20.13##淫羊藿水提物組　10　6.32±0.64#　103.63±11.05#

3.2 各組大鼠睪丸、附睪組織中MDA、SOD含量比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠睪丸、附睪組織中MDA、SOD含量比較（±s）

表2 各組大鼠睪丸、附睪組織中MDA、SOD含量比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與加味五子衍宗合劑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與五子衍宗方組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

睪丸　　附睪MDA（nmol/mL）　SOD（U/mL）　MDA（nmol/mL）　SOD（U/mL）正常組　10　2.54±1.60　125.93±29.13　2.66±0.87　125.83±23.25模型組　10　6.94±2.73**　68.96±22.49**　9.68±2.68**　76.04±12.18**加味五子衍宗合劑組　10　4.44±1.28#　118.93±22.43##　5.32±2.62##　113.11±10.23##五子衍宗方組　10　4.42±1.16#　107.82±24.87##　6.37±2.42##　106.27±10.62##△仙茅+淫羊藿水提物組　10　4.52±1.79#　103.76±14.59##　7.31±1.84#　99.84±9.03##△△仙茅水提物組　10　5.31±1.16　102.79±11.43##　7.90±1.33　86.98±11.04#△△▲▲淫羊藿水提物組　10　5.49±1.69　90.75±20.12#△△　7.96±1.75△　89.61±21.40△△▲組別　　動物數(shù)（只）

4 討論

男性不育病因比較復(fù)雜，大多數(shù)問題表現(xiàn)在少精或無精、弱精及死精癥。目前發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在弱精癥的整個發(fā)病過程中起著重要作用，過氧化物可以氧化核酸、蛋白質(zhì)等，破壞細胞的完整性。MDA作為不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物，其含量表示過氧化程度大小，是體內(nèi)活性氧含量高低的指標(biāo)，反映出抗氧化能力強弱，它能夠抑制精子線粒體功能以及腺甘酸環(huán)化酶等多種酶的活性，進而影響精子運動功能[11]。SOD活力的高低反映了機體清除氧自由基的能力[12]。病理情況下，體內(nèi)自由基及MDA增多，SOD活性下降，從本實驗結(jié)果可以看出，模型組大鼠睪丸、附睪組織中MDA含量明顯升高，SOD含量顯著降低。給藥后加味五子衍宗合劑組、五子衍宗方組、仙茅+淫羊藿水提物組大鼠睪丸、附睪組織中MDA含量降低，SOD含量升高；仙茅水提物組大鼠睪丸、附睪組織中SOD含量升高，淫羊藿水提物組大鼠睪丸組織中SOD含量升高，但仙茅水提物和淫羊藿水提物組MDA含量與模型組無明顯差異。說明各給藥組均能提高清除自由基的酶的活性和機體抵御自由基毒性的能力。仙茅水提物組和淫羊藿水提物組大鼠MDA含量沒有降低，而仙茅+淫羊藿水提物組大鼠睪丸、附睪組織中MDA含量降低，可能因為單味中藥水提物對MDA影響不夠，兩味藥協(xié)同作用才能加快MDA的清除速率，增強機體抗氧化能力。與加味五子衍宗合劑組比較，五子衍宗方組、仙茅+淫羊藿水提物組、淫羊藿水提物組、仙茅水提物組附睪組織中SOD含量降低，睪丸組織中SOD含量顯著降低，附睪組織中MDA含量升高，表明加味五子衍宗合劑相對于其組分藥物在提高SOD含量，降低MDA含量方面具有更好的藥效。與五子衍宗方組比較，仙茅水提物組、淫羊藿水提物組附睪組織中SOD含量更低，表明五子衍宗方相對于仙茅水提物和淫羊藿水提物在升高SOD含量方面具有更好的藥效。

由附睪分泌的α-葡糖苷酶，可催化多糖或碳水化合物分解為葡萄糖，參與活性精子成熟、獲能及受精過程，為精子代謝和運動供能，其活性高低可直接影響精液質(zhì)量，活性異常提示附睪功能障礙，是附睪的標(biāo)志酶和特異性酶。精子能量的主要來源之一是精囊分泌的果糖，WHO確定測定精漿果糖可用于評價精囊腺功能，其含量反應(yīng)精囊腺的分泌功能[13]。本實驗結(jié)果顯示，除五子衍宗方組與模型組果糖含量無顯著差異外，給藥組相對于模型組，大鼠附睪組織中α-葡糖苷酶、果糖含量明顯增高；與加味五子衍宗合劑組比較，五子衍宗方組α-葡糖苷酶含量降低，但無顯著性差異，但果糖含量則明顯降低。加味五子衍宗合劑相對于其組分中藥在增高α-葡糖苷酶、果糖含量方面具有更好的效果。

綜上，加味五子衍宗合劑比其組分中藥在改善抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激損傷方面更具優(yōu)勢，從而使精子活動力得到改善，其可能通過改善生殖細胞抗氧化作用和增加α-葡糖苷酶、果糖含量而提高了精子質(zhì)量。下一步將探討研究加味五子衍宗合劑及其組分中藥在分子水平上是否能夠上調(diào)垂體ACTH基因表達，治療腎陽虛證，以期更全面地揭示該方治療男性不育的機理。

[1] YINY，HAWKINS K L，DEWOLF W C，et al.Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice[J].J Androl，1997，18（2）：161.

[2] ZENG Q，F(xiàn)ENG W，ZHOU B，et al.Urinary metal concentrations in relation to semen quality：a cross-sectional study in China[J].Environ Sci Technol，2015，49（8）：5052.

[3] 葛爭艷，金龍，劉建勛.五子衍宗丸補腎壯陽作用的實驗研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（7）：174.

[4] 李曉萍，薛海嬌，郭麗娜，等.淫羊藿次苷抗疲勞及抗氧化作用[J].中國老年學(xué)雜志，2014，34（17）：4967.

[5] 董國明，張漢明.仙茅提取物與仙茅甙的補腎壯陽作用及其機理研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20（1）：123.

[6] 李軒，白勇，鐘樹懷，等.五子衍宗丸對不育患者精漿果糖影響的臨床研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2009，28（12）：1.

[7] 宮燕，史杰，謝高宇，等.淫羊藿苷對鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠附睪功能的干預(yù)作用[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（1）：48.

[8] 傅曉晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作腎陽虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的生化研究[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003（1）：23.

[9] 馬靜，張遠強，王宗仁，等.腺嘌呤致大鼠雄性不育發(fā)病機理的實驗研究[J].解剖學(xué)報，2005，36（3）：279.

[10] 沈自尹.中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986（10）：598.

[11] THIJSSEN V L，POSTEL R，BRANDWIJK R J，et al.Galectin-1 is essential in tumor angiogenesis and is a target for antiangiogenesis therapy[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（43）：15976.

[12] 曹國華，陳吉棣，劉小鵬，等.缺鋅及補鋅對鼠脂質(zhì)過氧化與超氧化物歧化酶的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，1999，71（11）：623.

[13] 王偉偉.育嗣靈2號方對弱精癥大鼠模型精子活率及精漿生化的實驗研究[D].鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院，2013.