王 喬, 費(fèi) 浩

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444;

2.中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所,江蘇蘇州215123)

高密度脂蛋白是體內(nèi)天然存在的脂質(zhì)納米粒子,主要由脂質(zhì)和載脂蛋白(Apo A-I等)組成,生物相容性好,體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長,是一種極具前景的藥物載體[1-2].目前已有大量研究證明,在體外利用Apo A-I蛋白或其類似物可以將磷脂組裝成類似高密度脂蛋白的納米粒子,成功輸送各種化合物或者多肽分子[3].Apo A-I蛋白由243個(gè)氨基酸組成,形成高度同源的10個(gè)雙親性螺旋結(jié)構(gòu)[4].Apo A-I蛋白的模擬肽(如18A,4F多肽等)與Apo A-I蛋白在氨基酸組成上沒有同源性,在二級結(jié)構(gòu)上模擬Apo A-I蛋白,具有雙親性的螺旋結(jié)構(gòu),并且陰離子性氨基酸和陽離子性氨基酸按照A類螺旋構(gòu)型分布[5-7].Apo A-I蛋白的模擬肽呈現(xiàn)電中性.此類雙親性螺旋多肽的疏水面與脂質(zhì)的疏水頭部相互作用,組成疏水性的內(nèi)腔,親水面與脂質(zhì)的親水性頭部暴露于水溶液[8].在前期工作中,本課題組利用Apo A-I蛋白第10個(gè)螺旋上的多肽,成功構(gòu)建了具有整合素靶向功能的脂質(zhì)納米粒子,實(shí)現(xiàn)了納米粒子的靶向運(yùn)輸[9],并且為了進(jìn)一步探究功能多肽是否可以通過脂質(zhì)納米粒子得到優(yōu)化,選取了陽離子雙親性多肽進(jìn)行驗(yàn)證.

陽離子雙親性多肽屬于陽離子性抗菌肽,是由親水和疏水氨基酸構(gòu)成的α螺旋結(jié)構(gòu)[10].此類多肽不但具有抗菌特性,而且對腫瘤細(xì)胞具有殺傷功能[11].大部分腫瘤細(xì)胞膜具有負(fù)電位,與陽離子雙親性多肽通過靜電引力相互作用,將多肽吸附到細(xì)胞表面引起細(xì)胞膜的破壞或者進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部引起線粒體、細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)的破壞,從而引起腫瘤細(xì)胞的死亡[12-13].但是陽離子多肽穩(wěn)定性差,易被多種酶消化降解,而借助適當(dāng)?shù)妮d體,可以提高多肽的穩(wěn)定性.本工作利用陽離子雙親性多肽的螺旋結(jié)構(gòu),使多肽與脂質(zhì)相互作用,形成類似高密度脂蛋白的納米粒子,提升多肽的抗酶解能力.目前,對于陽離子雙親性多肽形成類高密度脂蛋白納米粒子的研究還未見報(bào)道.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(dimyristoyl phosphatidyl choline,DMPC)購自Avanti公司;膽固醇油酸(cholesterol oleate,CO)、噻唑藍(lán)（MTT）購自Sigma公司;DMEM(High)培養(yǎng)基,RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司;R多肽(純度＞95%,相對分子質(zhì)量為1 849.31)由上海波肽公司合成;二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)、三氯甲烷等試劑購自國藥集團(tuán);糜蛋白酶和胰蛋白酶購自阿拉丁公司;96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿購自Corning公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多肽定量

將上海波肽公司合成的多肽通過nanodrop測定肽鍵在205 nm的吸收值,進(jìn)行準(zhǔn)確定量后使用.

1.2.2 脂質(zhì)納米粒子的制備

3μmol DMPC,0.1μmol CO溶于氯仿溶液,置于圓底離心管內(nèi),用穩(wěn)定的氮?dú)饬魇覝負(fù)]發(fā)氯仿1 h,混合物在離心管底部形成薄膜;加入1 mL磷酸緩沖液(phosphate buあer saline,PBS)(pH=7.4),室溫渦旋震蕩10 min,形成乳白色的乳濁液;充入氮?dú)?密封,在48?C水浴、功率200 W條件下,超聲1 h,形成DMPC/CO乳濁液;滴加等體積R多肽溶液,多肽與DMPC的摩爾比為1∶10,4?C放置過夜,得到脂質(zhì)納米粒子.脂質(zhì)納米粒子通過100 kD的超濾管進(jìn)行純化,去除游離的多肽、DMPC和CO分子.

1.2.3 脂質(zhì)乳濁液清除實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2節(jié)方法,在滴加多肽之前,獲得DMPC/CO乳濁液.取96孔板,每孔加入100μL乳濁液和100μL R多肽(多肽與脂質(zhì)的摩爾比為1∶10),室溫孵育,測定不同時(shí)間點(diǎn)溶液的吸收值(490 nm),表征多肽與脂質(zhì)相互作用的動(dòng)力學(xué)過程.

1.2.4 色氨酸熒光光譜藍(lán)移實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2節(jié)方法制備R多肽-脂質(zhì)納米粒子(R peptide-lipid nanoparticle,R-LNP).R-LNP和R多肽用PBS稀釋至0.2 mg/mL,測定兩個(gè)樣品的熒光光譜(激發(fā)光波長為295 nm).

1.2.5 透射電子顯微鏡檢測

將10μL脂質(zhì)納米粒子溶液滴在23目透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)專用銅網(wǎng)上,紅外干燥2 min,滴加3%磷鎢酸溶液,室溫靜置1 min,吸掉殘留的磷鎢酸溶液,在干燥器內(nèi)充分干燥,用120 kV的透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F20 S-TWIN)進(jìn)行觀察拍照.

1.2.6 動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)和zeta電位檢測

超濾純化后的R-LNP稀釋至0.05 mg/mL(多肽質(zhì)量濃度),取1 mL加入樣品池中,用NANOPHOX(Malvern)粒度儀進(jìn)行粒子直徑和電位測量.

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)

人體肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所.A549和MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液),兩種細(xì)胞均生長于37?C,5%CO2培養(yǎng)箱中.

1.2.8 細(xì)胞毒性檢測

取2塊96孔板,分別接種A549和MCF-7細(xì)胞,細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24 h;吸掉培養(yǎng)基,加入含有不同質(zhì)量濃度R多肽或R-LNP的新鮮培養(yǎng)基,孵育24 h;吸掉上清,加入100μL含有20%MTT(5 mg/mL)的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4 h;吸掉上清,每孔加入150μL DMSO,室溫震蕩孵育20 min,測量每個(gè)樣品孔在490 nm的吸收值,計(jì)算細(xì)胞的存活率.

1.2.9 穩(wěn)定性檢測

超濾純化的R-LNP與R多肽稀釋到0.3 mg/mL,與糜蛋白酶和胰蛋白酶在37?C條件下孵育,兩種酶的孵育質(zhì)量濃度分別為3.20和0.24μg/mL,孵育時(shí)間為60 min;孵育完畢,加入1/2體積的乙腈震蕩1 min,采用10 kD超濾管進(jìn)行超濾,去除較大的酶分子,進(jìn)行超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本工作選用陽離子雙親性R多肽(RLARLLRRLARWLR)進(jìn)行研究,其螺旋結(jié)構(gòu)的輪狀如圖1所示.R多肽的親水性氨基酸和疏水性氨基酸分別分布在螺旋的兩側(cè),藍(lán)色區(qū)域代表親水性氨基酸(精氨酸),黃色區(qū)域代表疏水性氨基酸(亮氨酸和色氨酸),灰色區(qū)域代表疏水性較弱的丙氨酸.

圖1 R多肽(RLARLLRRLARWLR)的螺旋結(jié)構(gòu)輪狀圖Fig.1 Helical wheel presentations of R peptide(RLARLLRRLARWLR)

2.1 R多肽與脂質(zhì)相互作用分析

通過脂質(zhì)乳濁液清除實(shí)驗(yàn),檢測R多肽促進(jìn)DMPC/CO乳濁液的重組.如圖2所示,R多肽瞬間降低乳濁液的渾濁度,隨后渾濁度繼續(xù)下降,直至平衡.此現(xiàn)象表明R多肽促進(jìn)了脂質(zhì)的重組,形成粒徑較小的脂質(zhì)納米粒子.當(dāng)多肽充分與脂質(zhì)結(jié)合后,通過R-LNP進(jìn)行超濾純化,測定R多肽中色氨酸熒光光譜的變化.如圖3所示,R-LNP中R多肽的熒光光譜出現(xiàn)9 nm的藍(lán)移,表明色氨酸所處的環(huán)境發(fā)生了改變,說明R多肽的疏水性部分嵌入了脂質(zhì)納米粒子的疏水核心中.

圖2 脂質(zhì)乳濁液清除實(shí)驗(yàn)Fig.2 Lipid emulsion clearance assay

2.2 R-LNP的形貌和表面性質(zhì)

R-LNP在120 kV的TEM形貌觀測結(jié)果如圖4所示,可見R-LNP呈現(xiàn)規(guī)則的圓形、粒徑均一、分散性好.根據(jù)DLS測量,R-LNP的平均粒徑為(14.7±0.1)nm(見圖5).進(jìn)一步對R-LNP表面的zeta電位進(jìn)行表征(見圖6),可知R-LNP的電位為17.8 mV,說明粒子在溶液中穩(wěn)定.上述結(jié)果均表明R多肽可以與脂質(zhì)相互作用,形成形貌規(guī)則、粒徑均一、表面性質(zhì)良好的納米顆粒.

圖3 色氨酸熒光光譜藍(lán)移實(shí)驗(yàn)Fig.3 Blue shift of TRP f l uorescence assay

圖4 R-LNP的TEM形貌Fig.4 TEM image of R-LNP

圖5 R-LNP的DLS測量Fig.5 DLS measurement of R-LNP

2.3 R-LNP的細(xì)胞毒性檢測

R多肽對癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用.本實(shí)驗(yàn)對R-LNP和R多肽在兩種不同的癌細(xì)胞(A549,MCF-7)中的殺傷作用進(jìn)行比較,檢測R-LNP是否保持R多肽的細(xì)胞殺傷作用.如圖7所示,在A549和MCF-7細(xì)胞中,R-LNP和R多肽呈現(xiàn)類似的MTT曲線,表現(xiàn)出相似的殺傷作用.進(jìn)一步的定量數(shù)據(jù)如表1所示,R-LNP與R多肽在A549細(xì)胞中的IC50分別為(5.93±0.75)和(7.45±0.74)μmol/L,在MCF-7細(xì)胞中的IC50分別為(4.36±0.40)和(6.58±0.50)μmol/L.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,R多肽與脂質(zhì)相互作用形成的R-LNP并沒有降低R多肽的癌細(xì)胞殺傷能力.

圖6 R-LNP的zeta電位測量Fig.6 Zeta potential measurement of R-LNP

圖7 R多肽和R-LNP對A549,MCF-7細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)Fig.7 MTT assay of R peptide and R-LNP for A549,MCF-7 cells

表1 R多肽與R-LNP細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)Table 1 Cytotoxicity data of R peptide and R-LNP

2.4 R-LNP穩(wěn)定性檢測

R-LNP利用脂質(zhì)作為載體,保護(hù)R多肽的疏水氨基酸,可能會(huì)增強(qiáng)多肽的抗酶解能力.R多肽與R-LNP分別與糜蛋白酶(3.20μg/mL)、胰蛋白酶(0.24μg/mL)在37?C條件下孵育60 min,通過UPLC分析比較二者的抗酶解能力.如圖8(a)和(b)所示,R多肽與R-LNP在滯留時(shí)間2.4 min左右出現(xiàn)目標(biāo)峰;與蛋白酶孵育后R多肽在2.4 min的主峰迅速下降,出現(xiàn)較多雜峰,如圖8(c),(e)所示;而R-LNP大大降低了多肽被降解的程度,表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,如圖8(d),(f)所示.

圖8 R多肽和R-LNP的穩(wěn)定性檢測Fig.8 Stability evaluation of R peptide and R-LNP

3 討論

本工作利用多肽-脂質(zhì)納米粒子的特殊組成和優(yōu)良功能,選取具有細(xì)胞毒性的陽離子雙親性R多肽(RLARLLRRLARWLR)作為研究對象.具有雙親性螺旋結(jié)構(gòu)的R多肽與脂質(zhì)形成的多層囊泡結(jié)構(gòu)相互作用,促使脂質(zhì)發(fā)生重組,克服表面張力作用,形成粒徑較小的納米粒子.在此重組過程中,脂質(zhì)乳濁液的渾濁度下降.通過測定混合物在490 nm處吸收值的改變可以檢測多肽與脂質(zhì)相互作用的動(dòng)力學(xué)過程.當(dāng)多肽充分與脂質(zhì)結(jié)合后,R多肽疏水性部分嵌入磷脂分子中,親水性部分暴露于脂質(zhì)納米粒子表面,色氨酸由水溶液環(huán)境轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中,伴隨有熒光光譜的變化,即藍(lán)移現(xiàn)象,這一現(xiàn)象與已有研究結(jié)果相符[14].除此之外,帶有正電荷的精氨酸暴露于脂質(zhì)納米粒子的親水面,導(dǎo)致脂質(zhì)納米粒子表面的zeta電位呈現(xiàn)17.8 mV的正電性.R-LNP的疏水性氨基酸(亮氨酸)埋藏于脂質(zhì)分子中,降低了與糜蛋白酶接觸的可能性,同時(shí)親水性氨基酸(精氨酸)受到表面磷脂分子空間位阻的作用,與胰蛋白的作用降低,有助于提高多肽對這兩種酶的抗酶解能力.多肽在體內(nèi)易被降解和清除[15],從而大大降低了多肽的治療作用,而R-LNP以納米粒子形式進(jìn)入體內(nèi)有可能延長R多肽在體內(nèi)的滯留時(shí)間和改善治療效果,這部分研究有待于進(jìn)一步驗(yàn)證.近年來,研究人員在利用多肽包裹或修飾脂質(zhì)納米粒子的工作中取得了很大進(jìn)展,Luo等[16]和Hunag等[17]利用逆序的4F多肽與鼻咽癌靶向肽或蜂毒肽共價(jià)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了納米粒子的靶向輸送或蜂毒肽溶血性的改善.本課題組將Apo A-I第10個(gè)螺旋上的一段多肽通過環(huán)化的RGD進(jìn)行二價(jià)化,大大提升了脂質(zhì)納米粒子的穩(wěn)定性,同時(shí)賦予納米粒子靶向整合素的特性.由此可知,多肽-脂質(zhì)納米粒子具有很好的靈活性,易進(jìn)行修飾和改造.此外,也有研究利用固體脂質(zhì)納米粒子或聚合物納米粒子優(yōu)化多肽的性質(zhì)[18],但是實(shí)現(xiàn)多肽的進(jìn)一步改造或納米粒子的多功能化仍較困難.未來可以通過進(jìn)一步設(shè)計(jì),在R多肽的基礎(chǔ)上添加靶向序列,增強(qiáng)納米粒子的特異性;利用不同電荷性質(zhì)的脂質(zhì)進(jìn)行納米顆粒的修飾,屏蔽納米粒子表面的正電荷,避免其與陰離子物質(zhì)相互作用,進(jìn)一步提升納米粒子的穩(wěn)定性;在脂質(zhì)納米粒子疏水核心添加具有成像等功能的疏水性化合物,實(shí)現(xiàn)多功能一體化目標(biāo).

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