徐 威,蘇明波,周宇波

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444;2.國家新藥篩選中心,上海201203)

組蛋白的共價修飾主要發(fā)生在賴氨酸(K)和精氨酸(R)殘基上,包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等,是一種重要的表觀遺傳調(diào)控作用機(jī)制.賴氨酸的甲基化和去甲基化在組蛋白修飾中尤為常見,主要由組蛋白去甲基化酶(histone dememethylase,HDM)和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase,HMT)共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)組蛋白的甲基化水平[1].大量研究表明:組蛋白的共價修飾作用參與眾多基因的表達(dá)調(diào)控,促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育,調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝,參與相關(guān)疾病腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,在表型和基因型之間承載著重要的橋梁作用[2].

類端粒沉默干擾體1(disruptor of telomeric silencing 1-like,DOT1L)是一種作用在組蛋白H3第79位賴氨酸(H3K79)上的甲基轉(zhuǎn)移酶,是目前所知在酵母菌和哺乳動物體內(nèi)唯一作用于該位點的甲基轉(zhuǎn)移酶[3].DOT1L不含大部分甲基轉(zhuǎn)移酶所共有的在進(jìn)化上極端保守的SET結(jié)構(gòu)域.除了調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄激活程序以外,DOT1L還參與DNA的修復(fù)、細(xì)胞的生長分化以及細(xì)胞周期的調(diào)控等[4].在體內(nèi)條件下,DOT1L的敲除將導(dǎo)致小鼠胚胎致死.DOT1L在小鼠胚胎干細(xì)胞的生長發(fā)育過程、心腦血管的發(fā)生和發(fā)展過程以及胚胎軟骨組織的形成中都發(fā)揮著重要作用[5].大量研究結(jié)果表明:由DOT1L催化調(diào)控的H3K79位點單,雙甲基化程度的異常與重組型混合系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[6].在重組型MLL細(xì)胞中,染色質(zhì)的異常轉(zhuǎn)位導(dǎo)致MLL基因與其融合伴侶(AF4,AF9或AF10)發(fā)生融合,使DOT1L異常聚集,促進(jìn)了H3K79位點的高度甲基化,導(dǎo)致諸如HOXA9和MEIS1的癌基因過量表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞的惡性增殖[7].重組型MLL可以發(fā)展成急性髓性白血病(acute myelocytic leukemia,AML)或者急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL),這表明DOT1L是潛在的白血病治療靶點[8].基于計算機(jī)水平的輔助測試新技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,極大地提高了靶點藥物篩選的時效性和可靠性[9].

目前在研的DOT1L抑制劑有3種:①2011年Epizyme公司推出了第一種DOT1L抑制劑EPZ004777,它是底物SAM的競爭性抑制劑,分子水平IC50約為0.4 nmol/L,選擇性較好,能顯著抑制重組型MLL細(xì)胞系和MLL-AF4,MLL-AF9型小鼠造血細(xì)胞的增殖[10];②2013年Epizyme公司推出了第二種DOT1L抑制劑EPZ-5676,其對DOT1L靶點有著更為強(qiáng)烈的抑制效果,分子水平IC50為80 pmol/L,選擇性較好,在抑制MLL-AF4重組型細(xì)胞MV-4-11的IC50為3.5 nmol/L,對H3K79位點雙甲基化程度抑制的IC50為3 nmol/L,目前處于臨床一期研究階段[11];③2012年加拿大多倫多大學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)會推出了另一種DOT1L小分子抑制劑SGC0946,分子水平IC50為300 pmol/L,對H3K79位點雙甲基化程度抑制的IC50為8.8 nmol/L,選擇性較好,對HOXA9和MEIS1基因的抑制效果更為顯著[12].

1 材料與方法

1.1 材料

SAM緩沖液:5 mmol/L硫酸,10%乙醇溶液.反應(yīng)緩沖液:50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸,pH=8.0,150 mmol/L氯化鈉,3 mmol/L氯化鎂,0.1%牛血清白蛋白.高鹽緩沖液:50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸,pH=7.4,1 mmol/L氯化鈉,0.1%Tween-20,0.3%多聚賴氨酸.檢測緩沖液:25 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸,pH=7.4,0.01%Tween-20.

1.2 實驗方法

本實驗采用PE公司提供的AlphaLISA DOT1L Histone H3 Lysine-N-methyltransferase Assay試劑盒檢測H3K79位點甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的活性,DOT1L小分子抑制劑高通量篩

選(high throughout screening,HTS)模型反應(yīng)原理如圖1所示.

表1 實驗試劑Table 1 Experiment reagents

圖1 DOT1L小分子抑制劑高通量篩選模型反應(yīng)原理Fig.1 Reaction mechanism of DOT1L small molecule inhibitors HTS model

由圖1可以看出,組蛋白核小體H3K79位點能夠在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的催化作用下,由低甲基化程度向高甲基化程度轉(zhuǎn)化.AlphaLISA能夠檢測核小體上甲基化修飾的H3K79位點的二甲基化(H3K79me2)程度.通過甲基化抗體將受體珠和供體珠連接在一起,當(dāng)發(fā)生甲基化時,給予680 nm波長的激發(fā)光,供體珠能夠產(chǎn)生高能態(tài)的單線氧.高能態(tài)的單線氧能夠進(jìn)一步激發(fā)受體珠發(fā)射出520～620 nm波長的熒光,通過檢測熒光強(qiáng)度來反映甲基化的H3K79me2含量.

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)酶濃度和反應(yīng)時間的確定

AlphaLISA活性檢測是一種基于終點法的測活方法,需要保證檢測時DOT1L甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活始終保持在初速度反應(yīng)水平,即在整個活性檢測過程中DOT1L的酶活始終保持在線性范圍內(nèi).

為了探索最佳反應(yīng)酶濃度和反應(yīng)時間,本工作設(shè)計了如下反應(yīng)實驗體系.在White Opaque OptiPlateTM-384孔板中依次加入1μL 10倍緩沖液,2μL終濃度依次為100,25,12.5,3.125,1.562 5,0 nmol/L的DOT1L酶.2μL 20μmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)和0.150 ng/μL寡聚核小體混合物,反應(yīng)時長為180,120,60,30,0 min.達(dá)到反應(yīng)時間后,用高鹽溶液終止反應(yīng),15 min后加入受體珠和抗體的混合液,60 min后加入供體珠,30 min后進(jìn)行Evision檢測.實驗結(jié)果如圖2所示.

圖2 反應(yīng)體系中最佳DOT1L酶濃度和最佳反應(yīng)時間的檢測Fig.2 Detection of the best enzyme concentration and reaction time

由圖2可以看出,隨著酶濃度的升高和反應(yīng)時間的延長,接收到的信號值逐漸增強(qiáng).但是,在高濃度DOT1L酶的催化作用下,整條曲線并非呈線性正相關(guān).綜合考慮節(jié)約成本、反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和實驗的可操作性,最終選定5 nmol/L的DOT1L酶濃度,反應(yīng)時長180 min.

2.2 寡聚核小體最佳濃度的確定

寡聚核小體是DOT1L高通量篩選體系建立實驗中重要的底物之一,組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L能夠?qū)⒑诵◇w組蛋白H3第79位的賴氨酸甲基化,實驗依賴于完整的核小體結(jié)構(gòu).為探索最佳寡聚核小體反應(yīng)濃度,選擇終濃度為0.150,0.125,0.100,0.075,0.050,0.025 ng/μL的寡聚核小體,5 nmol/L的DOT1L酶濃度,20μmol/L的SAM,反應(yīng)時長180 min,其他反應(yīng)條件不變.實驗結(jié)果如圖3所示.

圖3 反應(yīng)體系中底物核小體最佳濃度的檢測Fig.3 Detection of the best oligonucleosome concentration

由圖3可以看出:在一定濃度范圍內(nèi),接收到的信號值隨寡聚核小體濃度的升高而增大.實驗本底維持在一個相對較低的水平,證明了實驗的穩(wěn)定性.綜合考慮高通量篩選的需求和節(jié)約成本的原則,最終選定寡聚核小體的終濃度為0.150 ng/μL.

2.3 底物SAM反應(yīng)Km值的測定和最佳濃度的確定

組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L在適宜條件下可催化H3K79的甲基化水平升高反應(yīng),該反應(yīng)需要一個甲基的供體SAM.在底物SAM存在的條件下,DOT1L將SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到H3K79位的賴氨酸上,完成催化反應(yīng).為檢測SAM反應(yīng)的Km值,依次選擇終濃度為0.1,0.3,0.9,2.7,8.1,24.3,72.9和218.7μmol/L的SAM,5 nmol/L的DOT1L酶濃度,0.150 ng/μL寡聚核小體,反應(yīng)時長180 min,其他反應(yīng)條件不變.實驗結(jié)果如圖4所示.

圖4 反應(yīng)體系中底物SAM最佳濃度的檢測Fig.4 Detection of the best SAM concentration

由圖4可以看出,在一定范圍內(nèi),接收到的信號值隨SAM濃度的升高而增大,但達(dá)到一定濃度后,底物SAM的濃度不再成為體系中的限制因素,故信號值不再增大.最終檢測SAM在反應(yīng)體系中的Km值為13.46μmol/L,選定SAM的終濃度為20μmol/L.

2.4 多聚賴氨酸濃度的確定

多聚賴氨酸(poly-L-lysine,PL)是一種由20～30個賴氨酸殘基聚合而成的多聚蛋白復(fù)合體,具有優(yōu)良的抑菌防腐和食品保鮮功能.賴氨酸是人體必需氨基酸之一,是一種極性帶正電荷的堿性氨基酸.大量賴氨酸通過肽鍵復(fù)合到一起,為反應(yīng)體系提供了極強(qiáng)的極性環(huán)境,有利于反應(yīng)信號的穩(wěn)定和放大.PL最佳濃度檢測實驗結(jié)果如圖5所示.

利用AlphaLISA方法檢測DOT1L的酶活,需要保證實驗組和對照組的差異足夠大,形成的窗口足夠?qū)?為進(jìn)一步進(jìn)行小分子抑制劑的篩選打下基礎(chǔ).由圖5可以看出,PL的存在極大地提高了反應(yīng)的窗口值,在最高為0.300 00%的PL濃度條件下,實驗組信號值可以達(dá)到空白組信號值的13.2倍,并且隨著PL濃度的降低而減小.根據(jù)實驗結(jié)果,最終確定0.030 00%的PL濃度為最佳反應(yīng)濃度.

2.5 陽性抑制劑EPZ-5676抑制效果的確定

通過前期實驗已經(jīng)基本確定了反應(yīng)體系中各成分的最佳濃度與最佳反應(yīng)時間,10倍緩沖液,終濃度為5 nmol/L的DOT1L酶,20μmol/L的SAM,0.150 ng/μL的寡聚核小體,0.030 00%的PL高鹽溶液,反應(yīng)時間3 h,體系的穩(wěn)定性和可適用性需要進(jìn)一步以陽性化合物作驗證.EPZ-5676是一種國際公認(rèn)的選擇性較好的DOT1L二代抑制劑,是底物SAM的競爭型抑制劑,目前處于臨床一期研究價段.以EPZ-5676為陽性化合物,檢測其在分子水平的IC50值,結(jié)果如圖6所示.

圖5 反應(yīng)體系中PL最佳濃度的檢測Fig.5 Detection of the best PL concentration

圖6 陽性化合物EPZ-5676的IC50檢測Fig.6 Detection of the IC50 of positive compound EPZ-5676

利用優(yōu)化后的DOT1L測活體系,檢測不同濃度條件下EPZ-5676對DOT1L甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用(見圖6).結(jié)果顯示,陽性抑制劑EPZ-5676對DOT1L甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制IC50為0.48 nmol/L,與文獻(xiàn)[11]報道基本一致,說明已成功建立組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L高通量篩選模型.

2.6 篩選系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可操作性

高通量篩選實驗需要比較陽性對照組、未知樣品組以及陰性對照組的檢測結(jié)果,需要篩選數(shù)以萬計的未知樣品,耗費大量金錢和實驗材料.故在高通量篩選實驗開始之前,需要進(jìn)行一些小樣本容量的檢測實驗,以確定所建立的實驗體系是否適用于后續(xù)的大規(guī)模篩選體系.

為了保證在機(jī)器加樣條件下高通量篩選的穩(wěn)定進(jìn)行,本工作優(yōu)化了加樣過程,以確定是否適合進(jìn)行高通量篩選.并考察了高通量篩選體系中Bravo加樣系統(tǒng)以及酶活性檢測過程中可能引起的系統(tǒng)變異程度.Z′因子是關(guān)于信號區(qū)間和變異程度的組合,是衡量高通量篩選穩(wěn)定性與可靠性的重要指標(biāo),能綜合反映信噪比和測量偏差的大小.一般認(rèn)為,Z′＞0.5的篩選體系適合進(jìn)行高通量篩選.依據(jù)Z′因子計算公式,對所建立的DOT1L抑制劑篩選體系的Z′因子進(jìn)行檢測,結(jié)果為0.54(見圖7),符合高通量篩選的質(zhì)量控制要求,表明可以開展高通量篩選實驗.

圖7 Z′因子的測定Fig.7 Detection of the Z′factor

3 討論

分子水平藥物篩選過程是新藥開發(fā)與后續(xù)體內(nèi)評價的關(guān)鍵步驟,是一個通過應(yīng)用系統(tǒng)化的實驗手段從數(shù)以萬計的候選化合物中篩選出對某一特定靶點具有較高抑制活性的化合物的過程.這一過程要求實驗方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、自動化程度高,同時要盡可能地降低成本.近年來隨著能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展與成熟,多功能AlphaLISA法已逐漸成為被廣泛應(yīng)用的藥物篩選分析法.經(jīng)過充分的標(biāo)記特異性和交叉反應(yīng)驗證后的AlphaLISA法,可廣泛應(yīng)用于表觀遺傳中特定的甲基化、乙?；揎椀目焖贆z測.該方法穩(wěn)定性好,特異性強(qiáng),反應(yīng)過程無需洗滌[13].AlphaLISA DOT1L Histone H3 Lysine-N-Methyltransferase Assay方法將完整的寡聚核小體結(jié)構(gòu)作為底物,通過生物素鏈接的特異性識別H3K79位二甲基化程度的抗體,識別特定的表觀遺傳標(biāo)記,鏈霉親和素供體另一端攜帶的供體珠在接收到特定波長的激發(fā)光后將發(fā)射出高能態(tài)的單線氧.高能態(tài)單線氧被錨定在組蛋白H3C末端的受體珠接收后,釋放出另一特定波長的反射光,通過接收這一反射光的強(qiáng)度達(dá)到檢測組蛋白H3第79位賴氨酸二甲基化程度產(chǎn)物的目的.整個過程依賴于完整的空間核小體構(gòu)象結(jié)構(gòu),但是也有一定缺陷.首先,這種檢測方式不能排除熒光化合物的干擾;其次,如果化合物的作用方式并非在于抑制了酶的活性,而在于干擾了供體抗體與H3K79二甲基化位點的結(jié)合,或者干擾了受體抗體與H3的結(jié)合,都會導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生.在后續(xù)實驗中應(yīng)盡量避免這一結(jié)果帶來的影響.

以高通量篩選為基礎(chǔ)的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)技術(shù)是近年來迅速發(fā)展并被不斷優(yōu)化的藥物篩選分析新方法.高通量篩選以其快速、靈敏、規(guī)模大、成本低、穩(wěn)定性好、操作簡單、化合物用量少等特點而普遍受到藥物研發(fā)者的青睞.本工作結(jié)合組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L小分子抑制劑自身的研發(fā)特點,通過建立以能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)為基礎(chǔ)的高通量篩選模型,發(fā)掘具有新穎結(jié)構(gòu)的DOT1L小分子抑制劑,增強(qiáng)對于DOT1L靶點本身的認(rèn)識,在理解和闡述新的相關(guān)機(jī)制的同時,發(fā)現(xiàn)潛在的候選化合物.另一方面,通過與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族其他抑制劑篩選模型進(jìn)行比較分析,進(jìn)一步評價化合物的選擇性,篩選出抑制效果好、針對性強(qiáng)的DOT1L抑制劑,為后續(xù)臨床實驗打下堅實的基礎(chǔ).

4 結(jié)束語

本實驗通過建立以能量信號共振轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L高通量篩選模型,進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系,確定最終的最佳反應(yīng)DOT1L酶濃度為5 nmol/L,最佳底物SAM濃度為20μmol/L,最佳寡聚核小體濃度為0.150 ng/μL,PL濃度為0.030 00%,最佳反應(yīng)時長為3 h.利用優(yōu)化體系對DOT1L陽性抑制劑EPZ-5676進(jìn)行IC50檢測,得到IC50值為0.48 nmol/L,與已有文獻(xiàn)報道相一致,說明EPZ-5676可以作為DOT1L小分子抑制劑高通量篩選模型的陽性化合物.為了確保機(jī)器自動加樣的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,本工作對所建立的篩選模型的Z′因子進(jìn)行檢測,結(jié)果為0.54,達(dá)到了高通量篩選模型的建立標(biāo)準(zhǔn),表明已成功建立組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L小分子抑制劑高通量篩選模型.

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