李 銳 ，馬海林 ,2,，白建榮 ，張 潔 ，關(guān) 超 ，楊瑞娟 ，張叢卓

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所，山西忻州 034000；3.山西大豐種業(yè)有限公司，山西太原 030031）

雜種優(yōu)勢是保證和提高玉米產(chǎn)量的重要原因。我國玉米生產(chǎn)和育種面臨的主要限制因素是種質(zhì)基礎(chǔ)薄弱。解決此問題的重要途徑是從玉米多樣性中心系統(tǒng)引進優(yōu)良種質(zhì)，并根據(jù)雜種優(yōu)勢模式原理進行改良和利用。玉米是山西省的第一大作物，在山西有很多從事玉米育種的公司與研究單位。隨著商業(yè)化育種的進程加快，育種家們從國內(nèi)外引進了很多自交系，同時也對外引自交系按照育種目標進行改良。目前，很多自交系之間的親緣關(guān)系不清，雜種優(yōu)勢群的歸屬不明。如果對這些材料進行廣泛組配，通過后代的表現(xiàn)選育優(yōu)良組合，但由于人力、物力、財力等因素的影響，只能進行很少一部分的工作，并且由于環(huán)境因素的影響選擇效果并不會太理想。隨著分子標記技術(shù)的迅速發(fā)展并逐步應(yīng)用于玉米遺傳多樣性分析中，分子標記技術(shù)已經(jīng)在玉米自交系的遺傳多樣性分析及雜種優(yōu)勢群的劃分[1-7]、玉米品種指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[8-18]、雜交種真實性與純度檢測[19-21]等方面大量應(yīng)用。很多育種人員迫切希望目前成熟的分子標記技術(shù)及已測序完成的玉米基因組信息能應(yīng)用到實際的育種工作中，在基因型水平上預(yù)測雜種優(yōu)勢的親本組合，增加育種工作的目的性和預(yù)測性，加快育種進程。但目前此方面的研究甚少。

本研究對山西大豐種業(yè)公司多年來收集和培育的大量自交系進行了基因型分析和雜種優(yōu)勢群劃分；在此基礎(chǔ)上，以一個雜優(yōu)組合模式為例子，選擇出了一些候選親本自交系，并預(yù)測了一些潛在優(yōu)勢雜優(yōu)組合，這將為玉米自交系的高效選育和雜優(yōu)親本的最佳組配提供依據(jù)和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 自交系材料 1～81為收集與培育的自交系，82是先玉335、先玉508和先玉696的共同母本。83，84，85分別是先玉335、先玉508和先玉696的父本。86是鄭單958的母本鄭58，87是鄭單958的父本昌7-2（表 1）。

表1 試驗材料

1.1.2 SSR標記的引物 以中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》）的20對核心引物和20對輔助核心引物作為標記引物。

1.1.3 儀器與設(shè)備 擴增產(chǎn)物在美國PE公司Labchip GXTouch大分子分析系統(tǒng)進行分析。使用HT DNA Extended Range LabChip微流體實驗室芯片；HT DNA 1K Reagent Kit試劑盒；并使用LABCHIP GXT software USB軟件收集原始數(shù)據(jù)。Taq DNA聚合酶購于寶生生物工程（大連）有限公司；引物和dNTP等試劑購于上海生工生物技術(shù)有限公司。HTDNAExtended Range LabChip微流體實驗室芯片和HT DNA 1K Reagent Kit試劑盒均購于美國PE公司中國代理公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取、純化和檢測 采用混合提取法，每個供試材料2個樣本，每樣本由10個單株（隨機取樣）的葉片混合而成。采用CTAB法提取并純化DNA，用分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，調(diào)整DNA的工作液濃度為20 ng/μL，備用。

1.2.2 擴增與產(chǎn)物熒光檢測 擴增反應(yīng)在C1000擴增儀上進行。PCR反應(yīng)總體系為20 μL：10×PCR Buffer（25 mmol/LMg2+）2 μL，2.5 mmol/LdNTPs 1 μL，10 μmol/L SSR 引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 U，DNA模板 80 ng，ddH2O補足 20 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性1 min，60℃復性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析方法

1.3.1 遺傳多樣性分析與聚類 利用Reviewer software USB軟件進行圖像分析與數(shù)據(jù)收集。利用PowerMarker v3.25軟件分析統(tǒng)計每對引物的等位基因個數(shù)、基因型個數(shù)、等位基因頻率和多態(tài)性信息量（PIC），標記索引系數(shù)（Marker Index，MI），按Senior等提供的公式MI＝Allele×PIC計算，Allele為該引物的等位基因數(shù)。利用NTSYS－pc2.1軟件按照UPGMA方法對各材料進行聚類分析。

1.3.2 雜優(yōu)類群內(nèi)自交系差異位點比較 將雜優(yōu)類群內(nèi)自交系的40個位點的擴增帶型進行比較，找出相互之間位點差異數(shù)及具體位點。

1.3.3 雜優(yōu)組合的雜合位點數(shù)比較 將每個組配的雜優(yōu)組合的2個親本及每個源品種的2個親本的40個位點的擴增帶型組合成雜交種帶型，統(tǒng)計雜合位點數(shù)，每一位點是2條帶的是雜合位點。比較雜優(yōu)組合與源品種的雜合位點數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 87個自交系的遺傳變異分析

表2 SSR引物在87個玉米自交系中的等位變異及多態(tài)信息量

續(xù)表2

87個自交系在40個SSR位點檢測到的遺傳變異匯總?cè)绫?所示。共檢測出256個等位變異，每對引物檢測出1～15個等位變異，平均6.4個；其中，bnlg16lk8位點有15個等位變異，9個位點的等位變異數(shù)在10個以上，反映了在這些位點有高度的等位變異性；有7個位點只檢測出3個及以下等位變異，其中，umc1492y13是一態(tài)，表明這些材料在這些位點高度純合。40個位點的多態(tài)性信息量PIC值變化范圍在0.00～0.88，平均為0.59；PIC值在0.8以上有2個位點。標記索引指數(shù)MI變化范圍在1.00～8.61，平均為3.02。PIC值和標記索引指數(shù)MI值表現(xiàn)的趨勢和等位變異數(shù)的趨勢是類似的。這些材料的雜合度均為0，表明參試自交系都為純系。

2.2 聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示（圖1），大部分材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.77～0.98。在遺傳相似系數(shù)大約為0.80水平上可以將所有材料分為4大類。其中，第Ⅰ類包括4小類，第1小類包括82（PH6WC），表明此群為Reid種群；第2小類包括鄭58；第3小類和第4小類來源不清。第Ⅱ類分為2組，組1包括2個材料；組2分為2個組，其中一組包括83（PH4CV為335的父本）、84（PHB1M為508的父本）和85（PH5AD為696的父本），表明此類屬于Lancaster種群。第Ⅲ類包括9個材料，其中包括87（昌7-2），本群為塘四平頭群材料；第Ⅳ類群包括4個材料，可能屬于新的優(yōu)勢類群。

2.3 雜優(yōu)模式中親本群的選擇

從圖1可以看出有許多類群以及它們的親緣關(guān)系，但是它們組成的雜種模式是否是雜種優(yōu)勢模式，還需要進行許多研究。但是，我們知道先玉品種類的親本組合是雜種優(yōu)勢模式之一，即Reid×Lancaster模式，但它們有共同的母本和各自的父本。實際育種工作中，很多育種家也是通過用本地種質(zhì)改良先玉號的親本獲得改良自交系，以保持該模式的雜種優(yōu)勢。從圖1可以看出，42，43，44和82（先玉母本） 構(gòu)成了先玉母本群；13，14，15，16，17，18 和84（508父本）構(gòu)成了 508父本群；19和 83（335父本）構(gòu)成了335父本群；30和85（696父本）構(gòu)成了696父本群。

2.4 先玉模式強優(yōu)勢組合的親本預(yù)測

在選擇了改良親本群后，將對親本進行組合。從表3可以看出，先玉335、先玉508和先玉696的雜合位點數(shù)分別為28，27，25個。82與各類父本組合后，雜合位點數(shù)少于42與各類父本組合的雜合位點數(shù)；43分別與各類父本組合后，組合雜合位點數(shù)明顯少于相應(yīng)的對照，44分別與各類父本組合后，組合雜合位點數(shù)明顯多于相應(yīng)的對照。因此，選擇母本為 42 和 44，父本選擇 13，14，15，16，17，18，19，30 及 83（335 父本）、84（508 父本）、85（696父本）進行組配。42與16，17組配后的雜合位點數(shù)是25，都比508雜合位點少，從組合表中去除；42與83（335父本）、84（508父本）、85（696父本）組合后，分別與先玉335、先玉508、先玉696差異僅為2個位點，視為同質(zhì)品種，也去除。42與19組配后的雜合位點數(shù)是27，雖然沒有335雜合位點多，但也屬于多位點，應(yīng)考慮其中。經(jīng)比較后形成了推薦雜優(yōu)組合（表4）。

表3 玉米組合雜合位點分析

表4 玉米候選強優(yōu)組合

續(xù)表4

3 討論

雜種優(yōu)勢利用是玉米育種的基礎(chǔ)。為此，育種家們從實踐中總結(jié)出了許多雜種優(yōu)勢類群與各種雜優(yōu)模式。雖然，國內(nèi)雜優(yōu)類群按照標準種質(zhì)劃分為6大類[1]，但近年來，由于先玉品種和鄭單958在生產(chǎn)上的大面積推廣，大家普遍接受了這2種雜優(yōu)模式，很多育種家就是基于這2種模式進行大規(guī)模種質(zhì)改良與組配雜交組合。因此，在育種中，主要按先玉母本群、先玉父本群、鄭58群和昌7-2群劃分雜優(yōu)類群。本研究按這樣思路將所有自交系進行了雜種優(yōu)勢類群的劃分，使育種家們知道各自交系的歸群及親緣關(guān)系，指導他們有目標地按照雜優(yōu)模式進行組配。本研究也顯示還有一個新的類群，有可能是一個新的雜優(yōu)類群，建議加強對它的研究。

按照雜優(yōu)模式改良自交系，能方便應(yīng)用成熟的雜交模式培育新品種，近年來審定的很多品種就是這樣培育出來的，它們經(jīng)過改良有了一些新的特性如抗性或適應(yīng)性，又保持了原雜優(yōu)模式的強雜種優(yōu)勢。但是，改良系很多，能組配的組合更多，如何產(chǎn)生有效的組合在實踐中產(chǎn)生了困難。本研究比較了改良系與來源品種親本的位點數(shù)，篩選出了有效親本自交系。但將所有組合與對照品種的雜合位點數(shù)進行比較后發(fā)現(xiàn)，不是所有組合的雜合位點數(shù)等于或大于對照品種。研究表明，如果僅簡單地按目標雜優(yōu)類群進行組配是不夠的，有必要進一步把組合與對照品種的雜合位點數(shù)進行比較后選擇。本研究建議的雜優(yōu)組合的分子預(yù)測方法在研究中已被證明。當然，推薦的組合要經(jīng)過田間驗證。

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