高云龍，卓蘭云，陳瑤，陳秋杰，馬艷，黃憲章，吳新忠

1.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣州市海珠區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510288

免疫性血小板減少癥(ITP)原指不明原因的獲得性機(jī)體功能紊亂，使外周血血小板計(jì)數(shù)減少，皮下黏膜出血的一種臨床出血性疾病。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明ITP的發(fā)病是由于機(jī)體自身免疫功能紊亂，異?；罨腡淋巴細(xì)胞刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)自身血小板的抗體，使患者體內(nèi)血小板數(shù)量減少[1～2]。色氨酸(Trp)是T淋巴細(xì)胞增殖的必需氨基酸，Trp濃度減低會(huì)阻止T淋巴細(xì)胞的增殖。吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)是Trp沿犬尿氨酸(Kyn)途徑進(jìn)行分解代謝的關(guān)鍵酶和限速酶[3]，色氨酰-tRNA合成酶(TTS)能使Trp形成色氨酰-tRNA復(fù)合物，構(gòu)成蛋白質(zhì)合成的Trp庫(kù)，可拮抗IDO對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制。有研究顯示，約20%的慢性ITP患者對(duì)激素治療不敏感，并且在脾切除后可復(fù)發(fā)[4]。紫癜靈具有滋陰涼血的功效，臨床上常用于治療病程纏綿、反復(fù)出血的慢性ITP陰虛血熱證患者。本研究觀察治療前后患者T淋巴細(xì)胞IDO和TTS表達(dá)及血漿Trp、Kyn濃度的變化，從IDO/TTS介導(dǎo)的Trp代謝途徑探討紫癜靈治療ITP的作用機(jī)制。

1 臨床資料

選取2014年9月—2015年12月在廣東省中醫(yī)院就診的20例慢性ITP陰虛血熱證患者，其中男8例，女12例；年齡13～61歲，平均(31.42±11.37)歲；血小板計(jì)數(shù)(2～36)×109/L，平均(14.56±11.63)×109/L。符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]中ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；符合陰虛血熱證的辨證標(biāo)準(zhǔn)：皮膚出現(xiàn)瘀斑，斑色鮮紅或紫暗，五心煩熱，口干，潮熱盜汗，頭暈?zāi)垦?，舌紅、少苔或無(wú)苔，脈細(xì)數(shù)。排除糖尿病、高血壓病、消化道潰瘍、結(jié)核、肝炎等慢性疾病及其他自身免疫性疾??；采樣之前至少兩星期未使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療。

2 治療方法

患者組采用紫癜靈(藥物組成：熟地黃、龜板、水牛角、茜草、槐花各20 g，生地黃15 g，白芍、黃精、旱蓮草、女貞子、牡丹皮、連翹、貫眾、玄參各12 g，砂仁3 g)治療。每天1劑，水煎取汁300 mL，分2次口服。30天為1療程，治療2療程。治療期間不給予其他藥物治療。選取健康志愿者20例作為正常對(duì)照組，不做任何處理。

3 觀察指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.1 觀察指標(biāo) ①CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的IDO和TTS表達(dá)：抽取ITP患者治療前后及健康志愿者外周血各10 mL，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC濃度調(diào)整至 5×105個(gè) /mL。每一試管加入CD4+、CD8+抗體各 5 μL，4℃避光靜置 30 min。PBS洗滌1次，漩渦振蕩條件下加入500 μL固定劑，室溫靜置10 min。PBS洗滌1次，加入200 μL破膜劑重懸細(xì)胞，1 500 rpm離心15～20 min。除陰性對(duì)照管外，每管加入IDO抗體4 μL，1∶50稀釋的TTS抗體5 μL，室溫避光靜置30 min，再加入破膜劑洗滌1次。200 μLPBS將細(xì)胞懸起，加入羊抗兔IgG TTS抗體5 μL，4℃避光靜置30 min。PBS洗滌2次，用400 μL PBS重懸細(xì)胞，使用BD CantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)ACS Diva 7.0軟件分析流式的檢測(cè)結(jié)果，用CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO和TTS熒光表達(dá)強(qiáng)度來(lái)評(píng)估IDO與TTS的表達(dá)水平。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自德國(guó)Fresenius Kabi公司；CD8-PerCP/Cy5.5、CD4-PECY7購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；TTS-抗體購(gòu)自ePitomics公司；羊抗兔IgG TTS-APC二抗、兔抗人IDO抗體、固定劑、破膜劑購(gòu)自美國(guó)R&D公司。②液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)(LC-MS/MS)檢測(cè)IDO酶的活性：取100 μL的血漿樣品加200 μL乙腈，漩渦振蕩1 min，靜置30 min后14 000 g高速離心30 min，取上清液 10 μL加入色譜柱(Thermo Syncronis-C18)中進(jìn)行分析。流動(dòng)相：A相乙腈與水體積比為5∶95(含0.1%甲酸)，B相乙腈與水體積比為95∶5(含0.1%甲酸)，流速為0.2 mL/min。采用外標(biāo)法，以Trp和Kyn標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。L-Trp、L-Kyn購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以(±s)表示，正常對(duì)照組和患者組治療前的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，患者組治療前后的數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 療效標(biāo)準(zhǔn)與治療結(jié)果

4.1 療效標(biāo)準(zhǔn) 參照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)(2012年版)》[6]擬定。完全反應(yīng)：100×109/L≤治療后血小板計(jì)數(shù)，臨床無(wú)出血；有效：30×109/L＜治療后血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L，且至少比基礎(chǔ)血小板數(shù)增加2倍，臨床無(wú)出血；無(wú)效：治療后血小板計(jì)數(shù)＜30×109/L或臨床有出血。確定完全反應(yīng)和有效時(shí)至少檢測(cè)2次，間隔至少7天。

4.2 紫癜靈的治療效果 完全反應(yīng)10例，有效7例，無(wú)效3例，有效率85.0%。

4.3 2組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞IDO與TTS的熒光表達(dá)強(qiáng)度比較 見(jiàn)表1?；颊呓M治療前CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞IDO的平均熒光強(qiáng)度低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，TTS的平均熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。治療后，患者組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO的平均熒光強(qiáng)度較治療前上升(P＜0.05)，TTS的平均熒光強(qiáng)度較治療前下降(P＜0.05)。

表1 2組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞IDO與TTS的熒光表達(dá)強(qiáng)度比較(±s，n=20)

表1 2組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞IDO與TTS的熒光表達(dá)強(qiáng)度比較(±s，n=20)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與患者組治療前比較，②P＜0.05

組 別C D 4+T淋巴細(xì)胞 C D 8+T淋巴細(xì)胞正常對(duì)照組患者組治療前患者組治療后I D O 5 5 4.3 6±5 1.1 2 1 8 8.1 0±2 7.1 6①8 5 6.8 5±3 0 9.0 4②T T S 1 7 6 8.7 3±8 9.1 5 4 6 5 8.9 7±1 8 3.8 5①1 7 0 9.6 5±1 1 8 1.3 5②I D O 3 2 5.0 4±6 1.3 9 1 6 1.5 8±2 0.8 7①7 5 4.5 2±2 6 9.4 7②T T S 1 5 1 2.3 1±1 0 5.1 0 5 6 2 6.2 8±4 0 5.4 6①2 3 1 1.6 3±1 2 6 1.2 9②

4.4 2組血漿Trp、Kyn濃度比較 見(jiàn)表2?；颊呓M治療前血漿Trp及Kyn濃度均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療后，患者組Trp濃度較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Kyn濃度較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 2組血漿Trp、Kyn濃度比較(±s) μmol/L

表2 2組血漿Trp、Kyn濃度比較(±s) μmol/L

組 別正常對(duì)照組患者組治療前患者組治療后n 2 0 2 0 2 0 T r p 5.9 4 8±2.9 3 0 9.6 8 0±3.4 0 3①4.8 9 6±1.8 8 5②K y n 0.1 0 4±0.0 4 2 0.1 5 0±0.0 5 2①0.1 9 1±0.0 4 0②

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與患者組治療前比較，②P＜0.05

5 討論

ITP是由于機(jī)體自身免疫功能紊亂，異?；罨腡淋巴細(xì)胞刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)自身血小板的抗體，使血小板的生成減少或破壞增加，臨床表現(xiàn)為因血小板數(shù)量減少而誘發(fā)的出血性疾病。近年來(lái)，較多研究證明自身反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞為觸發(fā)和維持病理性抗血小板自身抗體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵[7～8]。同時(shí)，CD8+T淋巴細(xì)胞也可通過(guò)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用參與ITP的發(fā)病。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ITP歸屬于血證范疇，《血證論》中提出治血主要為寧血、止血、補(bǔ)血和消瘀四大治法。慢性ITP臨床多表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜，病機(jī)以陰虛血熱為主，主要以為滋陰涼血為治法。紫癜靈具有清熱涼血、化瘀生新、寧絡(luò)止血的功效，同時(shí)可補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)陰填精、清熱解毒瀉火。方中熟地黃、龜板、白芍、黃精、早蓮草、女貞子補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)陰填精，以顧肝腎本虛；水牛角、生地黃、牡丹皮、茜草、槐花清熱降火涼血，兼以化瘀生新、寧絡(luò)止血；連翹、貫眾、玄參清熱解毒瀉火，以祛火毒之實(shí)；砂仁理氣和胃，使補(bǔ)藥不壅滯，苦藥不傷胃?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紫癜靈組方中連翹、茜草、牡丹皮等能增強(qiáng)毛細(xì)血管的致密性，保持毛細(xì)血管的正常抵抗力，縮短出血及凝血時(shí)間[9]。程宗琦等[10]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了紫癜靈具有抑制單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，同時(shí)能顯著縮短出血時(shí)間，臨床上對(duì)于皮膚紫癜等疾病的滲出性出血具有很好的緩解作用。

Trp是T淋巴細(xì)胞活化與增殖的必需氨基酸，通過(guò)IDO與TTS調(diào)節(jié)Trp的分解代謝，參與調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ITP患者的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO的表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，而患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中TTS的表達(dá)量卻明顯高于正常對(duì)照組。有研究表明，TTS表達(dá)上調(diào)和IDO介導(dǎo)的Trp代謝異常共同參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，活化的T細(xì)胞可以利用氨基酸的能力增強(qiáng)，TTS表達(dá)上調(diào)以增加細(xì)胞內(nèi)色氨酰-tRNA的儲(chǔ)備，同時(shí)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制機(jī)制，減少I(mǎi)DO介導(dǎo)的Trp降解[11]。治療前患者血漿中Trp和Kyn濃度較正常對(duì)照組高，表明體內(nèi)Trp仍可通過(guò)IDO途徑代謝，IDO在體內(nèi)不斷消耗，Kyn的濃度相應(yīng)升高；但Trp濃度未出現(xiàn)降低，可能與TTS的高表達(dá)儲(chǔ)備氨基酸能力增強(qiáng)有關(guān)。

服用中藥紫癜靈合劑后，治療有效組患者的IDO在CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，而TTS的表達(dá)則下降。Trp濃度下降，Kyn濃度上升。說(shuō)明紫癜靈的治療使TTS表達(dá)下降，減少色氨酸-tRNA復(fù)合物的貯存量。IDO的活性增高使其更好的發(fā)揮免疫抑制作用，T淋巴細(xì)胞的增殖受到抑制，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的活化減弱，減少了對(duì)自身血小板的破壞。此結(jié)果表明，在ITP患者體內(nèi)，IDO的免疫抑制作用并沒(méi)有減弱，是由于TTS加載的色氨酸-tRNA蛋白復(fù)合物增加了IDO酶的消耗，無(wú)法正常發(fā)揮其應(yīng)有的免疫調(diào)節(jié)作用。治療無(wú)效的患者TTS表達(dá)未見(jiàn)明顯減低，可能與患者體內(nèi)存在保護(hù)TTS酶活性的物質(zhì)或拮抗紫癜靈藥物活性的成分有關(guān)，無(wú)法抑制T淋巴細(xì)胞增殖，使得新生血小板繼續(xù)破壞。

本研究通過(guò)檢測(cè)慢性ITP患者體內(nèi)的IDO/TTS介導(dǎo)Trp代謝過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)紫癜靈可能是通過(guò)降低慢性ITP陰虛血熱證患者體內(nèi)的TTS表達(dá)，減弱了TTS對(duì)IDO的拮抗作用，使患者已受損的免疫抑制功能得到一定程度的恢復(fù)和改善?；颊叩呐R床癥狀有所好轉(zhuǎn)甚至完全緩解，為紫癜靈治療慢性ITP患者的機(jī)制研究提供參考。

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