胡 娟，羅世瓊，楊占南*，趙 鋮，韋小芳，霍鴻浩，張曲玲

(1. 貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點實驗室，貴州 貴陽 550001；2. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550001)

【研究意義】貴州施秉云臺山是舞陽河國家級風(fēng)景名勝區(qū)的重要組成部分，為典型的喀斯特地形地貌，具有獨特的自然景觀和豐富的植被生態(tài)系統(tǒng)[1-2]，人為干擾少。以白云巖、石灰?guī)r、泥灰?guī)r等碳酸鹽類長期風(fēng)化的石灰缺磷土壤為主[3-4]。由于磷是限制植物生長最重要的營養(yǎng)元素之一，在云臺山石灰石缺磷土壤生長的豐富植物已形成了植物吸收有效磷素的適應(yīng)機(jī)制。研究該適應(yīng)機(jī)制對云臺山生態(tài)環(huán)境的保護(hù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】云臺山生態(tài)環(huán)境生長條件下，植物獲得磷的來源主要通過吸收礦物質(zhì)中無機(jī)磷素以及動植物殘體分解的磷素[5-8]，由于土壤存在大量解磷微生物，能夠?qū)⒅参锊荒芪盏牧邹D(zhuǎn)化為植物可以直接吸收的形態(tài)[9-10]。然而，對于有機(jī)難溶磷素轉(zhuǎn)化為植物可吸收的有效磷素的機(jī)理尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】盡管有關(guān)土壤有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力研究已有大量的文獻(xiàn)報道[11-13]，然而，對施秉云臺山獨特的土壤有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力及其生長狀況的相關(guān)研究鮮見報道。因此，研究施秉云臺山土壤有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力及其生長狀況，對了解其植物磷的吸收機(jī)制以及生態(tài)系統(tǒng)的維護(hù)具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】以施秉云臺山喀斯特土壤的有機(jī)磷細(xì)菌為研究對象，分析有機(jī)磷細(xì)菌的溶磷指數(shù)、磷酸酶活性、生長狀況及碳源的利用率，以探明貴州施秉云臺山土壤有機(jī)磷細(xì)菌的解磷機(jī)制，為云臺山喀斯特自然保護(hù)區(qū)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)及可持續(xù)發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 取樣 有機(jī)磷細(xì)菌分離于貴州施秉云臺山喀斯特土壤，從山腳到山頂垂直高度每間隔100 m采集土壤樣品，采集土壤深度為0～20 cm，共10樣地，每個樣地又采集3個樣點，分別置于透明無菌塑料袋，帶回實驗室，過2 mm篩，剔除石子和植物根系，混合。貯藏于4 ℃冰箱，用于有機(jī)磷細(xì)菌分離、純化。

1.1.2 培養(yǎng)基制備 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NaH2PO4·H2O 0.5 g，(NH4)2SO42.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，蒸餾水 1000 mL。

固體養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，酵母浸粉 0.5 g，瓊脂 20 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CaCl20.1 g，去離子水1000 mL，卵磷脂(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

液體培養(yǎng)基：參照蒙金娜培養(yǎng)基[12]進(jìn)行改進(jìn)，酵母粉0.5 g，瓊脂20 g，葡萄糖10 g，(NH4)2SO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，NaCl 0.3 g，CaCO35 g，MnSO4·7H2O 0.002 g，去離子水 1000 mL，pH 7.0～7.2，卵磷脂。

固體和液體培養(yǎng)基加入卵磷脂前，需121 ℃滅菌30 min。

卵磷脂制備：用75 %酒精消毒棉球擦洗干凈雞蛋外殼，去掉蛋清，將2個蛋黃置于已滅菌的 100 mL 燒杯中，加水(無菌)40 mL混合均勻即成卵磷脂，1000 mL培養(yǎng)基加入蛋黃液60 mL。

1.1.3 分離純化 在超凈工作臺中稱取土壤樣品10 g，加入250 mL已裝有無菌去離子水90 mL和少許玻璃珠的三角瓶中，封口后置于25 ℃恒溫?fù)u床以 141 r/min震蕩30 min。采用10倍稀釋法形成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的土壤稀釋液，分別取0.1 mL涂布在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，每個濃度3次重復(fù)。涂布完畢，靜置15 min 后，封口，倒置于生化培養(yǎng)箱(25 ℃)，暗光培養(yǎng)3～5 d，待透明斑出現(xiàn)，即有機(jī)磷細(xì)菌。再接種到純化培養(yǎng)基中，不斷分離、純化得出有機(jī)磷細(xì)菌，選取其中4株進(jìn)行下一步試驗。

1.2 解磷能力分析方法

采用溶磷指數(shù)評價得到的有機(jī)磷細(xì)菌對卵磷脂的解磷能力。將分離純化得到的菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，點接種法接種到純化固體培養(yǎng)基中，5次重復(fù)，封口，倒置平板置于生化培養(yǎng)箱25 ℃，暗光培養(yǎng)5 d后，測定其菌落的菌圈和溶磷圈大小。計算溶磷指數(shù),

溶磷指數(shù) = (溶磷圈-菌圈)/菌圈。

1.3 磷酸酶活性測定

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，分別將分離純化得到的懸浮液1 mL置于10 mL離心管中，然后加入甲苯0.2 mL和磷酸緩沖液(pH 6.5)3 mL，再加用磷酸緩沖液配制的對硝基苯磷酸二鈉溶液(0.05 mol/L)1 mL，搖勻加蓋，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，然后加入1 mL CaCl2(0.5 mol/L)及3 mL NaOH (0.5 mol/L)，搖勻，2500 r/min離心5 min，取上清夜于10 mL離心管4000 r/min再離心5 min，取上清液410 nm比色，用752型紫外分光光度計測定吸收光值。以每mL有機(jī)磷細(xì)菌懸浮液每小時消耗對硝基苯磷酸二鈉的μmoL數(shù)表示磷酸酶活性。

1.4 有機(jī)磷細(xì)菌的生長狀況

取液體培養(yǎng)基置于50 mL三角瓶(25 mL/瓶)中，3 次重復(fù)。滅菌后，每瓶分別接入分離純化得到的懸浮液2 mL，并設(shè)置對照，28 ℃培養(yǎng)，用752型紫外分光光度計測定0、1.5、3.5、6、8、12、16、18和20 h 時液體培養(yǎng)液的OD。根據(jù)OD值的變化反映有機(jī)磷細(xì)菌的生長狀況。

1.5 碳源的利用率測定

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別制成含1 %葡萄糖和蔗糖作為碳源的2種培養(yǎng)液，以 50 mL/瓶置于100 mL三角瓶中，滅菌后，每瓶分別接入分離純化得到的懸浮液2 mL，對每種培養(yǎng)液設(shè)置1個對照，3次重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)6 h用752型紫外分光光度計測定培養(yǎng)液的透光率，計算其相對碳源的利用率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)通過Excel進(jìn)行整理和繪圖，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析、單因素方差分析(ANOVA)檢驗樣地間酚類物質(zhì)、土壤特征是否存在差異顯著；采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中分離純化的菌株

經(jīng)不斷分離、純化得到40株有機(jī)磷細(xì)菌，選取其中4株編號分別為OPBS12、OPBS13、OPSB14和 OPBSB32進(jìn)行下一步試驗(圖1)。

a=OPBS12, b=OPBS13, c=OPSB1, d=OPBSB32圖1 土壤中分離的有機(jī)磷細(xì)菌Fig.1 Isolated organophosphate bacteria from soil

菌株Strain溶磷圈(cm)Dissolvingphosphorusring菌圈(cm)Bacteriacircle溶磷指數(shù)DissolvedphosphorusindexOPSB131.53b1.10a1.39cOPSB121.43b0.93a1.54cOPSB321.50b0.78b1.94bOPSB142.20a0.78b2.84a

注：同列不同小寫字母表示各菌株對的溶磷圈、菌圈及溶磷指數(shù)差異顯著 (P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) between the dissolved phosphate circle, the bacterial circle and the dissolved phosphorus index of the same strain.

2.2 有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力

由表1顯示，OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32的4株有機(jī)磷細(xì)菌的溶磷指數(shù)為1.39～2.84，溶磷指數(shù)最高值為最低值的1.47倍，其中OPSB14與OPBS12、OPBS13和OPBSB32的溶磷指數(shù)存在顯著性差異，表明其溶磷能力存在顯著性差異；OPBSB32與OPBS12和OPBS13溶磷指數(shù)存在顯著性差異，表明其溶磷能力存在顯著性差異。各菌株溶磷指數(shù)可知，OPSB14的溶磷能力最強(qiáng)，4株有機(jī)磷細(xì)菌的溶磷能力為OPSB14﹥OPBSB32﹥OPBS12﹥OPBS13。

2.3 有機(jī)磷細(xì)菌的磷酸酶活性

菌株來源于貴州施秉云臺山森林表層土壤為弱酸性，故分析液體培基中各菌株分泌胞外酶(磷酸酶)活性。由圖2可見，各菌株的磷酸酶活性為35.79～83.28 mmol/(mL·h)，且最高值比最低值高出48.49 mmol/(mL·h)。OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32的磷酸酶活性間均呈顯著差異，其磷酸酶活性大小為OPSB14[83.28 mmol/(mL·h)]﹥OPBSB32[64.57 mmol/(mL·h)]﹥OPBS12[47.67 mmol/(mL·h)]﹥OPBS13[35.79 mmol/(mL·h)]，與溶磷能力的結(jié)果相一致。說明，OPSB14、OPBSB32、OPBS12和OPBS13降解有機(jī)磷素的能力存在顯著性差異，表明不同磷酸酶活化土壤能力存在差異。

2.4 有機(jī)磷細(xì)菌的生長狀況

由圖3顯示，OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32培養(yǎng)液不同有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)液的OD值隨培養(yǎng)時間的增加而增加，其OD值的變化趨勢為OPSB13>OPSB12>OPSB32>OPSB14。除OPBS14和OPSB32培養(yǎng)液在 0～8 h時的OD值變化差異不顯著外，OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32培養(yǎng)液的OD值隨生長時間的變化均呈顯著差異性。說明OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32菌株在培養(yǎng)液中的生長速度存在差異，部分差異顯著；其生長速度為OPSB14﹥OPBSB32﹥OPBS12﹥OPBS13，其OPSB14的生長速度最快，OPBS13的生長速度最慢，與解磷能力及磷酸酶活性的試驗結(jié)果基本一致。然而，OPSB14的解磷能力最強(qiáng)，磷酸酶活性最高，生長繁殖速度最快，暗示具有較強(qiáng)的活化土壤有機(jī)磷素的能力，具有作為微生物肥料的開發(fā)應(yīng)用價值。

小寫字母表示不同菌株磷酸酶活性差異顯著 (P < 0.05)The lowercase letters indicate that the phosphatase activity of the different strains is significantly different (P < 0.05)圖2 有機(jī)磷細(xì)菌分泌的磷酸酶活性Fig.2 The activity of organic phosphorus bacteria secrete phosphatase

圖3 不同培養(yǎng)時間各有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)液的OD值Fig.3 The OD value of organophosphorus bacteria culture solution at different culture time

2.5 有機(jī)磷細(xì)菌對碳源的利用率

由圖4顯示，不同有機(jī)磷細(xì)菌對葡萄糖和蔗糖碳源的相對利用率。OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32對葡萄糖碳源的相對利用率存在顯著性差異，相對利用率為OPBS13>OPBS32>OPBS12>OPBS14，最高碳源的相對利用率(OPBS13)是最低碳源的相對利用率 (OPBS14)的3.61倍；而OPBS13對蔗糖碳源的相對利用率與OPBS12、OPSB14和OPBSB32對蔗糖碳源的相對利用率呈差異性顯著，而OPBS12、OPSB14和OPBSB32對蔗糖碳源的相對利用率之間差異性未顯著，相對利用率為OPBS14>OPBS32>OPBS12>OPBS13；OPBS13和OPBS32對葡萄糖碳源的相對利用率大于對蔗糖碳源的相對利用率，OPBS14和OPBS12則相反。而對溶磷能力強(qiáng)的OPBS14，適量利用蔗糖作為碳源，有利于其生長發(fā)育。OPBS13對葡萄糖的利用最佳，OPBS12和OPSB14對蔗糖的利用最佳，而OPBS32對葡萄糖和蔗糖的利用均佳。表明，有機(jī)磷細(xì)菌的生長受不同碳源的影響，不同的有機(jī)磷細(xì)菌適應(yīng)于不同的碳源轉(zhuǎn)化，這為有機(jī)磷細(xì)菌大規(guī)模的擴(kuò)繁和利用提供重要的應(yīng)用價值。

3 討 論

磷元素是植物繁衍生息所必須的大量元素之一，也是植物的重要組成部分，并在植物代謝及生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。研究表明，土壤中存在無數(shù)微生物，將難溶解態(tài)磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锬芪盏挠行B(tài)，將這些微生物統(tǒng)稱為解磷微生物。其中能將動植物殘體有機(jī)態(tài)磷分解為無機(jī)態(tài)磷的細(xì)菌即有機(jī)磷細(xì)菌。從施秉云臺山喀斯特土壤分離、純化的4株有機(jī)磷細(xì)菌，OPSB14 的溶磷能力最強(qiáng)，生長曲線顯示其生長速度也最快，具有可作為微生物肥料的開發(fā)利用價值。

不同大小寫字母表示同一菌株對不同碳源和不同菌株對同一碳源的相對利用率存在顯著差異性(P<0.05)Different capital letters indicate that there is a notable difference in the relative utilization of different carbon atoms in the same strain (P<0.05); Different lowercase letters indicate that there is a notable difference in the relative utilization of the same carbon in different strains (P<0.05) 圖4 有機(jī)磷細(xì)菌對碳源的相對利用率Fig.4 Relative utilization rate of organic phosphorus bacteria to carbon source

有機(jī)物中的磷元素轉(zhuǎn)化主要依賴于有機(jī)磷細(xì)菌，該細(xì)菌通過向周圍環(huán)境分泌胞外磷酸酶，將有機(jī)態(tài)磷通過酶解轉(zhuǎn)化為無機(jī)態(tài)磷，從而提高磷素的吸收效率。其中，磷酸酶主要參與土壤有機(jī)磷素的降解，使有機(jī)物中的結(jié)合磷轉(zhuǎn)化為植物有效吸收的磷組分，從而提高土壤中磷元素對植物的有效性。因此，有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力與磷酸酶的活性密切相關(guān)。有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)液的光密度(OD)較準(zhǔn)確反映其培養(yǎng)液的有機(jī)磷細(xì)菌濃度或生長速度變化，因此，利用分光光度計，通過分析有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)液的OD值評價有機(jī)磷細(xì)菌濃度高低或生長速度快慢，即透光率大說明有機(jī)磷細(xì)菌濃度低或生長速度慢，反之亦然。通過比較，4株菌的磷酸酶活性為OPSB14>OPBSB32>OPBS12>OPBS13，與溶磷能力的結(jié)果相一致。但其解磷能力還受營養(yǎng)、碳源、pH等因素的影響。該研究中，各有機(jī)磷細(xì)菌對碳源的利用也存在差異，解磷優(yōu)勢菌株OPSB14對蔗糖的相對利用率高，因此，可以通過改變培養(yǎng)條件，最好地發(fā)揮有機(jī)磷細(xì)菌的解磷優(yōu)勢從而應(yīng)用于生產(chǎn)。

4 結(jié) 論

通過對從貴州云臺山森森林土壤篩選的4 株有機(jī)磷細(xì)菌的溶磷指數(shù)、磷酸酶活性、生長狀況、碳源利用率分析，初步明確，不同有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力存在差異，其解磷能力與有機(jī)磷細(xì)菌分泌胞外磷酸酶活性有關(guān)，并且受不同碳源利用的影響，為進(jìn)一步研究貴州云臺山土壤有機(jī)磷降解以及植物對土壤磷素吸收機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

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