索雅飛,杜超,李寧寧，王燕，王迎春

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021)

逆境脅迫是制約植物生長發(fā)育，影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素[1]。逆境脅迫主要分為兩種：生物脅迫和非生物脅迫。目前非生物脅迫對植物生長發(fā)育的影響是人們研究的一大熱點(diǎn)。非生物脅迫主要包括干旱、鹽、高溫、紫外照射等，其中鹽、干旱是主要的環(huán)境抑制因素[2]。鹽、干旱脅迫下植物體內(nèi)會(huì)積累過多的活性氧，如：-OH，O2-·，H2O2等，活性氧會(huì)導(dǎo)致膜脂過氧化，對膜質(zhì)造成損傷，形成氧化脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育[3]。因此，抗氧化系統(tǒng)的研究對了解植物抗逆機(jī)制具有重要意義。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，是生物體內(nèi)普遍存在的金屬酶，是一種極有效的抗氧化劑[4]，其主要功能是清除生物體內(nèi)過多的O2-·，防止膜脂過氧化，使植物細(xì)胞免受O2-·的破壞[5-6]，SOD作為植物體中抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線，對植物抵御逆境脅迫發(fā)揮著重要作用。目前，SOD基因已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、煙草(Nicotianatabacum)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、小麥(Triticumaestivum)[10]、豌豆(Pisumsativum)[11]、番茄(Lycopersicumesculentum)[12]、陸地棉(Gossypiumhirsutum)[13]等多種植物中被克隆，且研究表明，在擬南芥、煙草、苜蓿(Medicagosativa)等植物中過表達(dá)不同的SOD基因均可提高其抗逆性。例如將小麥的Cu/ZnSOD基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，擬南芥中SOD、CAT、APX、GR等酶活性及NADPH氧化酶(NOX)活性升高，植株對鹽和H2O2的抗性增強(qiáng)[10]；將擬南芥的FeSOD轉(zhuǎn)入煙草中后，煙草的抗氧化性增強(qiáng)[7]；將煙草的MnSOD轉(zhuǎn)入紫花苜蓿后，MnSOD在線粒體中過量表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物的耐冷性增強(qiáng)，產(chǎn)量增加[8]。由此可見，SOD基因作為植物體內(nèi)重要的抗氧化相關(guān)基因與植物抗逆性密切相關(guān)，但目前這些研究主要集中在一些模式植物和農(nóng)作物中，針對野生植物的研究較少。已有研究發(fā)現(xiàn)一些來源于野生植物的抗氧化相關(guān)基因在增強(qiáng)植物抗逆性方面具有突出的表現(xiàn)[14-15]，因此，從野生植物中挖掘抗氧化相關(guān)基因并驗(yàn)證其功能具有重要意義。

長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)，又名黃花紅砂、黃花琵琶柴，隸屬于檉柳科(Tamarieaceae)琵琶柴屬(Reaumuria)，是亞洲中部亞區(qū)東阿拉善-西鄂爾多斯特有種，內(nèi)蒙古自治區(qū)重點(diǎn)保護(hù)植物[16-18]。長葉紅砂具有鹽腺、針狀肉質(zhì)葉片及下陷的氣孔等特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對鹽生荒漠環(huán)境具有獨(dú)特的適應(yīng)性[19-25]。在對環(huán)境的適應(yīng)過程中，其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被顯著激活，進(jìn)行活躍的解毒活動(dòng)[26]。黨振華[27]對長葉紅砂轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因SOD、POD、APX、GSH、GRX等在脅迫條件下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，說明這些基因可能在長葉紅砂抵抗逆境過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，長葉紅砂抗氧化系統(tǒng)的研究對探索植物耐鹽機(jī)制，發(fā)現(xiàn)特有耐鹽決定因子，挖掘相關(guān)抗逆基因具有重要意義。本研究利用PCR技術(shù)克隆得到RtSOD基因的開放閱讀框，對其進(jìn)行序列及表達(dá)分析，之后構(gòu)建植物表達(dá)載體pPZP221-RtSOD，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株后對其進(jìn)行鹽、干旱脅迫處理，進(jìn)一步分析該基因在植物抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮的功能。此研究對深入了解長葉紅砂在非生物脅迫下的抗氧化機(jī)制具有重要意義，為研究野生植物的抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對開發(fā)和利用野生植物資源，篩選優(yōu)異基因，培育抗逆牧草新品種具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，擬南芥哥倫比亞野生型種子(Col-0)和農(nóng)桿菌GV3101均由內(nèi)蒙古大學(xué)祁智教授惠贈(zèng)，植物表達(dá)載體pPZP221由內(nèi)蒙古大學(xué)哈斯阿古拉教授惠贈(zèng)。

1.2 長葉紅砂幼苗培養(yǎng)及脅迫處理

長葉紅砂種子剪去絨毛，NaClO溶液浸泡10 min，無菌水沖洗3次后將其播種于固體MS培養(yǎng)基中。在24 ℃、濕度70%，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)一個(gè)月，長到約10 cm高度，轉(zhuǎn)移到1/2 MS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，在液體培養(yǎng)基中生長10 d后，收集植物材料，分別對其根、莖、葉的RNA進(jìn)行提取，3組重復(fù)，用于RtSOD基因的組織特異性分析。

挑選長勢相近幼苗分別用NaCl(0、200、400、600 mmol·L-1)、PEG(20%)、4 ℃、H2O2(20 mmol·L-1)、ABA(10 μmol·L-1)處理0、3、6、12、24、48、72 h，每個(gè)處理分別為3個(gè)株系，且每個(gè)處理重復(fù)3次。收集材料，液氮速凍，提取植株RNA，然后保存于-80 ℃，用于分析不同脅迫條件下該基因在長葉紅砂中的表達(dá)特性。

1.3 長葉紅砂RtSOD基因開放閱讀框的克隆

長葉紅砂總RNA的提取參照RNA Plant Plus Regen (TaKaRa)中多糖多酚植物組織RNA提取說明書進(jìn)行，cDNA合成參照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)已有的長葉紅砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫及ORF Finder找出RtSOD基因預(yù)測的開放閱讀框，在其兩端設(shè)計(jì)帶有BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物，RtSOD-F:5′-CGGGATCCATGGCCACCAAC-3′;RtSOD-R:5′-GGGGTACCTCAGT TCGGAGTCAG-3′，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增ORF，PCR反應(yīng)總體系25 μL，內(nèi)含10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、Taq 酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 5 s；60 ℃復(fù)性 30 s；72 ℃退火 2 min；72 ℃延伸 10 min，35個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后將產(chǎn)物插入pMD-19T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，之后經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后測序。

1.4 長葉紅砂RtSOD基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)識(shí)別開放閱讀框(open reading frame， ORF)并翻譯推測出氨基酸序列；通過在線軟件 ProtParam(http://www.expasy.org)進(jìn)行預(yù)測基因編碼的蛋白分子量、理論等電點(diǎn)及保守結(jié)構(gòu)域等；利用ClustalX和Mega5.05[28]軟件分別進(jìn)行多序列比對分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.5 qRT-PCR分析RtSOD基因的表達(dá)量

本實(shí)驗(yàn)利用Rotor Gene Q Real-time PCR Platform系統(tǒng)進(jìn)行，RtSOD用于qRT-PCR的特異引物為RtSOD-F′:5′-AACTATCTCGCCACTCCCTCTCT-3′；RtSOD-R′：5′-TTGGGTCAAAGTAACAACTCCTTC-3′；β-Actin內(nèi)參基因引物序列Actin-F′: 5′-CTGGATTCTGGTGATGGTGTGTCT-3′; Actin-R′:5′-GAACCACCGATCCAGACACTGTAC-3′。反應(yīng)總體系20 μL，內(nèi)含SYBR Premix Ex TaqII 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線從65～95 ℃，3次重復(fù)。用2-ΔΔCt法[28]計(jì)算不同處理?xiàng)l件下RtSOD基因的相對表達(dá)水平。

1.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

選取測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI雙酶切pPZP221和pMD-19T-RtSOD質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收RtSOD基因和pPZP221載體的目的片段。將雙酶切得到的目的基因片段與pPZP221真核表達(dá)載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到克隆菌中，涂到含有壯觀霉素(spectinomycin， Spe)的抗性平板上過夜培養(yǎng)，挑菌，PCR驗(yàn)證，將條帶正確的菌液送去測序，最終得到pPZP221-RtSOD陽性重組載體。

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

將植物表達(dá)載體pPZP221-RtSOD轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，在篩選培養(yǎng)基(LB+100 mg·L-1Spe+50 mg·L-1Rif)上獲得轉(zhuǎn)化菌落，PCR驗(yàn)證，得到RtSOD農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株。

將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌活化擴(kuò)培后，離心收集菌體，加入5%的蔗糖溶液重懸，將A600調(diào)到0.8后加入0.1% 6-BA和0.03% Silwet L-77，混勻。挑選健壯的擬南芥進(jìn)行浸染，用準(zhǔn)備好的浸染液浸染擬南芥花序5 min后，罩膜，置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，之后在正常條件下培養(yǎng)。待角果成熟后，收集種子，加入變色硅膠干燥，之后進(jìn)行篩選。

1.8 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體的篩選及驗(yàn)證

將經(jīng)過消毒處理的100粒轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代種子播種于含50 μg·mL-1的慶大霉素(gentamicin,Gent)的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約1周后，選擇長根及有4片綠色真葉的幼苗移到營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗健壯，取植株組織進(jìn)行PCR鑒定，方法參照TransDirectTMPlant Tissue PCR Kit 試劑盒，電泳檢測PCR產(chǎn)物，挑選有明顯條帶的株系繼續(xù)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，最終篩選出表達(dá)量較高的3個(gè)株系繼續(xù)培養(yǎng)收獲種子，之后取T2代種子繼續(xù)播種于含50 μg·mL-1Gent的1/2 MS培養(yǎng)基上，選出呈3∶1性狀分離培養(yǎng)皿上的陽性幼苗移至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，收種子。之后取T3代的種子繼續(xù)播種到抗性培養(yǎng)基上，篩選100%成活培養(yǎng)皿上的幼苗移到營養(yǎng)土中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體。

1.9 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性分析

1.9.1鹽、干旱脅迫后RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥根長的測定 將野生型(WT)和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥種子(S2，S5，S6)表面消毒后播種在1/2MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后將幼苗移到0，100，150 mmol·L-1NaCl和0，100，150，200 mmol·L-1甘露醇(mannitol)的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后分別測定不同濃度NaCl和甘露醇處理后幼苗的根長，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.9.2鹽、干旱脅迫后RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮重及葉綠素含量的測定 將野生型(WT)和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥種子(S2，S5，S6)表面消毒后播種在1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d后移到營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，將植株分為3組，一組作為對照繼續(xù)培養(yǎng)，一組植株用150 mmol·L-1NaCl處理10 d，另一組植株停止?jié)菜珊堤幚?0 d，同一時(shí)間分別收集脅迫處理和未經(jīng)脅迫處理的植株，分別測定其鮮重、葉綠素含量，之后將材料用液氮凍干，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9.3SOD、POD、CAT活性及MDA、脯氨酸(Pro)、H2O2含量的測定 參照科銘生物公司的SOD、POD、CAT、MDA、H2O2、Pro等檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.10 鹽、干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥脅迫相關(guān)基因表達(dá)量的測定

將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥用鹽和干旱脅迫處理后(如1.9.1所示)，收集植株，液氮凍干，提取RNA后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Rotor Gene Q Real-time PCR Platform系統(tǒng)測定植株中擬南芥脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量。通過登錄號(hào)查找到相關(guān)基因引物序列(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長葉紅砂RtSOD基因ORF的克隆

從長葉紅砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到RtSOD的基因序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)帶有BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行克隆，結(jié)果與預(yù)期相符，得到長為663 bp的目的條帶(圖1)，之后進(jìn)行膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，菌液PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在663 bp處有明亮條帶，表明重組菌中成功轉(zhuǎn)入目的基因，將菌液送去測序。測序結(jié)果顯示所得序列正確，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 擬南芥脅迫相關(guān)基因引物序列Table 1 The primer sequence of stress-related gene in A. thaliana

2.2 RtSOD基因氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

圖1 RtSOD基因ORF片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 The ORF amplification of RtSOD gene M：DL2000 marker; S:RtSOD gene.

氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，RtSOD與剛毛檉柳(Tamarixhispida，GenkBank登錄號(hào)AHH91635.1)、鹽角草(Salicorniaeuropaea，登錄號(hào)AFD50705.1)、葡萄(Vitisvinifera，登錄號(hào)NP_001268067.1)、陸地棉(Gossypiumhirsutum，登錄號(hào)AAZ41971.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，登錄號(hào)NP_565666.1)中SOD基因的同源性較高，分別為92%，84%，81%，80%和75%。多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，RtSOD屬于Cu/Zn超氧化物歧化酶家族，同家族其他蛋白一樣，含有部分保守結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。RtSOD與Cu/Zn超氧化物歧化酶家族的其他蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RtSOD與檉柳科的剛毛檉柳的SOD基因親緣關(guān)系最近，聚為一類(圖3)。

2.3 RtSOD基因表達(dá)特性分析

2.3.1RtSOD基因的組織特異性表達(dá)分析 qRT-PCR分析結(jié)果顯示，RtSOD在不同組織中表達(dá)量有顯著差異，主要在莖中表達(dá)，根和葉中表達(dá)量均較低，表達(dá)趨勢為：根<葉<莖(圖4)。

圖2 長葉紅砂、鹽角草、剛毛檉柳、葡萄、陸地棉和擬南芥SOD氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of Cu/Zn SOD from R. trigyna, S. europaea, T. hispida, G. hirsutum, V. vinifera and A. thaliana 黑色陰影表示保守氨基酸序列; 線內(nèi)區(qū)域表示Cu/Zn SOD家族保守區(qū); 星號(hào)和黑點(diǎn)分別代表銅、鋅離子結(jié)合位點(diǎn)Black backgrounds show conserved amino acid. Red line show conserved region of Cu/Zn SOD superfamily proteins. Asterisks and black spot mean Cu2+ and Zn2+ binging site.

圖3 RtSOD與其他植物SOD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of RtSOD and the other plants SOD protein

2.3.2不同非生物脅迫RtSOD基因表達(dá)特性分析

圖4 RtSOD基因組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Tissue specific expression analysis of RtSOD 不同小寫字母表示P<0.05水平上的顯著差異性The different letters mean significant difference at P<0.05.下同The same below.

qRT-PCR分析RtSOD基因在NaCl、4 ℃、20% PEG、H2O2和ABA處理后長葉紅砂中的表達(dá)特性(圖5)。結(jié)果顯示：在不同濃度NaCl脅迫下，隨濃度的升高RtSOD基因表達(dá)量呈先降低后升高之后又降低的趨勢，在200和600 mmol·L-1濃度下顯著低于對照組，而在400 mmol·L-1NaCl濃度下升高且顯著高于對照組(圖5A)，因此之后選取400 mmol·L-1NaCl對其進(jìn)行脅迫，分析不同時(shí)間梯度RtSOD基因的表達(dá)量，結(jié)果表明鹽脅迫3和6 h時(shí)無明顯差異，脅迫12 h后逐漸升高，24 h達(dá)到最高，之后逐漸降低，且48 h后顯著低于對照(圖5B)。在4 ℃脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長，RtSOD基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，在12 h時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸降低(圖5C)。PEG脅迫和ABA、H2O2處理下，RtSOD基因表達(dá)量均隨時(shí)間的延長呈先降低后上升之后又降低的趨勢，PEG脅迫下其表達(dá)量在6 h時(shí)顯著降低，12 h時(shí)達(dá)到最高(圖5D)。ABA處理下3 h時(shí)顯著降低，之后逐漸升高，在6 h時(shí)達(dá)到最高，之后降低(圖5E)。 H2O2處理下RtSOD基因在6 h時(shí)表達(dá)量顯著降低， 12 h時(shí)達(dá)到最高，之后降低(圖5F)。以上結(jié)果表明不同非生物脅迫均可誘導(dǎo)長葉紅砂RtSOD基因的表達(dá)。

2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)含KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增RtSOD基因ORF序列后，目的基因質(zhì)粒酶切后與pPZP221酶切質(zhì)粒連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pPZP221-RtSOD(圖6)。陽性菌落通過PCR進(jìn)行驗(yàn)證，上下游引物分別為RtSOD-BamHI-F、RtSOD-KpnI-R，對其質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。PCR結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，得到663 bp的pPZP221-RtSOD序列。重組質(zhì)粒酶切后得到的兩條片段與目的基因和載體片段大小相符，最終確定重組載體構(gòu)建成功。

圖5 RtSOD基因在不同脅迫處理幼苗中表達(dá)量Fig.5 Expression of RtSOD in R. trigyna seedlings under different stress treatments

2.5 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

圖6 pPZP221-RtSOD重組表達(dá)載體Fig.6 pPZP221-RtSOD recombinate vector

將pPZP221-RtSOD陽性重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選出的T1代擬南芥通過基因組PCR和qRT-PCR的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因擬南芥的7個(gè)株系中S1，S2，S3，S5，S6，S7均可擴(kuò)增出RtSOD的特異片段，而野生型擬南芥無擴(kuò)增，說明RtSOD基因成功在S1，S2，S3，S5，S6，S76個(gè)株系中表達(dá)，而S4株系可能出現(xiàn)了假陽性。之后通過qRT-PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因株系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RtSOD在S2，S5，S6株系中表達(dá)量最高且明顯高于野生型(圖7)，最終篩選出S2，S5，S6三個(gè)株系繼續(xù)傳代，在含50 μg·mL-1Gent的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到T3代獲得成活率100%、穩(wěn)定遺傳的RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(圖8)，用于后續(xù)研究。

圖7 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥qRT-PCR驗(yàn)證Fig.7 qRT-PCR identification of transgenic A. thaliana

圖8 抗生素培養(yǎng)基上篩選的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥Fig.8 Screening of transgenic A. thaliana on medium with gentamycin

M: DL2000 marker; WT: 野生型Wild-type; S1～S7:RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥RtSODtransgenicA.thaliana. WT:野生型Wild-type; S2,S5,S6:轉(zhuǎn)基因擬南芥TransgenicA.thaliana.下同The same below.

2.6 不同脅迫下RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性分析

2.6.1RtSOD基因的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽、干旱脅迫的耐受性 首先對野生型擬南芥和S2，S5，S6三個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系根長進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因幼苗的根長無明顯差別，在100、150 mmol·L-1NaCl脅迫下，幼苗根長隨濃度增加逐漸縮短，但轉(zhuǎn)基因株系明顯長于野生型，且在150 mmol·L-1NaCl濃度下差異顯著(圖9)。在100、150、200 mmol·L-1甘露醇脅迫下，隨著甘露醇濃度的增加幼苗生長受到影響，但轉(zhuǎn)基因株系根長仍顯著長于野生型(圖10)。上述結(jié)果都表明RtSOD基因的過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株對鹽、干旱脅迫的耐受性。

圖9 NaCl脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長的檢測Fig.9 Measurement of primary root length of RtSOD transgenic and wild-type A. thaliana under NaCl stress

為了進(jìn)一步確定RtSOD基因與植物抗逆性的關(guān)系，對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽、干旱脅迫下的表型進(jìn)行了分析，并測定其鮮重和葉綠素含量。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取150 mmol·L-1為最適NaCl脅迫濃度對植物進(jìn)行鹽脅迫，停止?jié)菜畬ζ溥M(jìn)行干旱脅迫，脅迫時(shí)間10 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況無明顯差異，鹽和干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因植株明顯好于野生型(圖11A)。且脅迫后轉(zhuǎn)基因植株的鮮重和葉綠素含量都顯著高于野生型(圖11B、C)。綜合分析說明，RtSOD基因的過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物對鹽和干旱脅迫的耐受性。

2.6.2RtSOD基因的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽、干旱脅迫下的抗氧化能力 由于RtSOD基因與植物的抗氧化系統(tǒng)相關(guān)，因此，為了確定脅迫條件下RtSOD在擬南芥抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮的功能，檢測了鹽、干旱脅迫下RtSOD轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中SOD，POD，CAT活性，MDA、脯氨酸及H2O2含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD，POD，CAT活性升高且顯著高于野生型(圖12)。MDA和H2O2的含量較對照升高，但轉(zhuǎn)基因顯著低于野生型(圖12)。此外，脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的脯氨酸含量升高且顯著高于野生型(圖12)。這些結(jié)果表明，RtSOD基因的過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株中的抗氧化酶活性及脯氨酸含量，降低活性氧積累，減輕膜損傷，從而提高轉(zhuǎn)基因植物的抗氧化性。

圖10 甘露醇脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長的檢測Fig.10 Measurement of primary root length of RtSOD transgenic and wild-type A. thaliana under mannitol stress

圖11 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆分析Fig.11 Resistance analysis of RtSOD transgenic A. thaliana

圖12 野生型和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD,POD,CAT活性及MDA,H2O2,脯氨酸含量Fig.12 SOD,POD,CAT activity and MDA,H2O2, proline content of wild-type and RtSOD transgenic A. thaliana

圖13 NaCl脅迫下野生型和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中脅迫相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.13 Expression analysis of stress-related genes in RtSOD transgenic lines and wild-type plants under salt stress

2.6.3鹽、干旱脅迫下RtSOD的過表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫相關(guān)基因的表達(dá) 利用qRT-PCR測定了150 mmol·L-1NaCl和干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在鹽脅迫下(圖13)，RtSOD轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化相關(guān)基因AtAPX1，AtCAT1和AtPOD1，鹽脅迫相關(guān)基因AtSOS1及脯氨酸合成相關(guān)基因AtP5CS2表達(dá)量都顯著高于野生型。干旱脅迫下，RtSOD轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化相關(guān)基因AtSOD1，AtCAT1，AtPOD1，脯氨酸合成相關(guān)基因AtP5CS1以及干旱脅迫相關(guān)基因AtRD29A的表達(dá)量都高于野生型(圖14)。由此說明，鹽、干旱脅迫條件下，擬南芥中RtSOD基因的過表達(dá)可能通過提高抗氧化、脯氨酸合成以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量，從而增強(qiáng)其對脅迫的耐受性。

圖14 干旱脅迫下野生型和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.14 Expression analysis of stress-related genes in RtSOD transgenic lines and wild-type plants under drought stress

3 討論

作為植物響應(yīng)逆境脅迫過程中重要抗氧化酶，SOD可被多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，從而發(fā)揮作用，使得植物能夠適應(yīng)脅迫環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)鹽、干旱、高溫、低溫等非生物脅迫均可誘導(dǎo)植物體內(nèi)SOD的表達(dá)，從而提高其抗逆性[29-34]。長葉紅砂作為一種獨(dú)特的強(qiáng)旱生泌鹽鹽生植物，鹽脅迫下其體內(nèi)SOD活性明顯升高，進(jìn)而推測長葉紅砂對荒漠環(huán)境具有極強(qiáng)適應(yīng)性的原因之一是由于SOD活性水平的升高[26]，因此，研究RtSOD基因的功能對進(jìn)一步挖掘長葉紅砂逆境調(diào)控機(jī)制具有深遠(yuǎn)的意義。本研究從長葉紅砂中克隆得到RtSOD基因，之后根據(jù)逆境脅迫下其他植物中SOD的表達(dá)特點(diǎn)選取了NaCl、4 ℃、PEG、H2O2以及ABA等非生物脅迫研究RtSOD的表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 ℃脅迫下RtSOD基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，而在NaCl、PEG、H2O2以及ABA脅迫下，RtSOD基因表達(dá)量隨時(shí)間變化呈先降低后升高之后又降低的趨勢，說明多種環(huán)境脅迫均可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，不同脅迫下基因的表達(dá)模式有一定差異，但其表達(dá)峰值均出現(xiàn)在6 h以后，說明當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的活性氧積累逐漸增加，當(dāng)活性氧積累達(dá)到一定水平時(shí)，才會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)RtSOD基因的表達(dá)，并達(dá)到峰值，之后隨著體內(nèi)活性氧被清除，其表達(dá)量降低。

將RtSOD轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入擬南芥，進(jìn)一步研究RtSOD基因的抗逆功能，結(jié)果顯示，在鹽、干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中的根長、生物量及葉綠素含量都較野生型高，說明RtSOD基因的過表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對非生物脅迫的耐受性。這與先前其他關(guān)于SOD基因的研究結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)基因煙草中Cu/ZnSOD基因的過表達(dá)增強(qiáng)其對非生物脅迫的抗性[35]。Negi等[36]的研究表明,SOD基因可通過提高植物中其他抗氧化酶活性及促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來增強(qiáng)植物抗鹽能力。在本研究中發(fā)現(xiàn)RtSOD基因過表達(dá)后，鹽和干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性及脯氨酸含量均升高，H2O2和MDA含量降低，表明RtSOD基因也可通過提高抗氧化酶活性及促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累來增強(qiáng)其對鹽、干旱脅迫的耐受性。此外，轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗氧化相關(guān)基因AtSOD1、AtPOD1、AtCAT1，脯氨酸合成關(guān)鍵基因AtP5CS1，以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因AtSOS1的表達(dá)量均上調(diào)，基于這些抗逆相關(guān)基因在植物抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮的重要功能[37-39]，推測RtSOD基因也可能通過誘導(dǎo)這些脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物的抗氧化能力、促進(jìn)植物的滲透調(diào)節(jié)能力及維持植物體內(nèi)離子平衡能力，從而增強(qiáng)其抗逆性。

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