田　偉，　黃學(xué)卿，　王黎洲，　周　石，　安天志，　宋　杰，　蔣天鵬

肝硬化作為一種慢性肝臟系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為彌漫性肝纖維化，伴隨假小葉和再生結(jié)節(jié)形成［1］。臨床癥狀主要表現(xiàn)為肝功能損害和門靜脈高壓癥［2］，晚期可出現(xiàn)消化道出血、肝性腦病和繼發(fā)感染等嚴(yán)重并發(fā)癥［3］。其發(fā)病機(jī)制在我國主要是病毒性肝炎，其它病因包括膽汁淤積、循環(huán)障礙、工業(yè)中毒、藥物濫用、代謝紊亂、營養(yǎng)不良、免疫紊亂及其它未知因素［4］。細(xì)胞氧化損傷與許多慢性疾病有關(guān)。肝硬化小鼠存在明顯的氧化和抗氧化失衡［5］。正常條件下，肝臟中氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中［6］。某些因素通過激活氧分子引起肝組織脂質(zhì)過度氧化，從而引起肝損傷［7］，而自由基產(chǎn)生與脂質(zhì)過氧化協(xié)同作用，會產(chǎn)生自由基反應(yīng)和肝臟損害［8］，進(jìn)而加重炎性反應(yīng)和肝損傷［9］。這種病理性改變，被認(rèn)為是肝硬化患者難治的原因［10］。鞣花酸（ellagic acid，EA）具有多種生物活性，如抗氧化、抗突變、抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）作用［11］，也是一種有效促凝劑，對各種細(xì)菌和病毒具有良好抑制作用［12］。它可保護(hù)傷口表面免受細(xì)菌侵襲和感染，并抑制潰瘍形成［13］。有研究表明EA具有降壓、鎮(zhèn)靜作用［14］。本研究旨在探討EA對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)肝硬化的保護(hù)作用是否是經(jīng)由活性氧（ROS）和血管再生途徑，進(jìn)而抑制肝硬化病程發(fā)展。

1　材料與方法

1.1　動物模型與實(shí)驗(yàn)分組

本研究方案獲得了醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。取C57BL/6無特定病原體（SPF）級雄性小鼠（醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）40 只，體質(zhì)量為（20±2） g，均飼養(yǎng)于（25.1±1.0）℃、12 h 為一周期的光/暗交替標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境；隨機(jī)分為對照組（n＝10）和肝硬化模型組（n＝30），對照組小鼠僅接受0.9%氯化鈉溶液，肝硬化模型組小鼠由橄欖油稀釋10%CCl4誘導(dǎo)構(gòu)建肝硬化（2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，連續(xù)6周）。肝硬化模型形成第4周，根據(jù)EA干預(yù)與否及給予劑量，模型組又隨機(jī)分為未干預(yù)組（n＝10）、7.5 mg/kg EA組（n＝10）、15 mg/kg EA 組（n＝10），EA 干預(yù)持續(xù) 5周。

1.2　血清生化檢查

獲取肝組織勻漿樣品，在110℃6 N氯化氫（HCl）中水解，并在 60℃氯胺（2.5 mg）和范式乙基氨基苯甲醛混合液中孵育30 min；采用560 nm分光光度計(jì)（美國Amersham生物科學(xué)公司）讀取血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平。

1.3　肝組織病理檢查

采集肝組織樣本于4%甲醛中固定，梯度乙醇脫水、二甲苯清除乙醇，浸入石蠟制作切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.4　膠原蛋白Ⅰ檢測

TRIzol試劑（美國Sigma-Aldrich公司）提取肝組織樣本中膠原蛋白Ⅰ總RNA，RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒（美國Fermentas生命科學(xué)公司）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法合成 2 μg RNA。cDNA擴(kuò)增使用特異性引物序列：上游5′-CAGAGTGGAAGAGCGATTA-3′， 下 游 5′-CAAGGACAGTGTAGGTGAA-3′；擴(kuò)增過程在DNA恒溫箱（美國Applied Biosystems公司）（95℃ 10 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，×40 周期，4℃保存）中進(jìn)行。

1.5　ROS檢測

肝組織勻漿標(biāo)本采集后在10 000 r/min分離機(jī)中離心10 s，持續(xù)3次，選取其中30 μg蛋白，二辛可酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）檢測ROS水平。檢測原理為：ROS存在條件下，二氯二乙酸酯（DCFH-DA）被氧化生成二氯（DCF）熒光素，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正比。

1.6　氧化應(yīng)激檢測

血液標(biāo)本采集后在12 000 r/min分離機(jī)中離心10 min，冷卻至室溫，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒及分光光度計(jì)（美國Amersham公司）檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性。

1.7　蛋白印跡檢測

采集肝組織樣本進(jìn)行均質(zhì)處理，在10 000 r/min分離10 s，持續(xù)3次，BCA試劑盒測定總蛋白。取50 μg蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液（TBST）封閉2 h，加入抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（1︰4 000）、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）抗體（1︰2 500）、抗VEGF 受體（VEGFR）-2 抗體（1︰3 000）、抗 β-肌動蛋白（actin）抗體（1︰5 000，美國 Santa Cruz 生物技術(shù)公司）4℃過夜；TBST洗滌3次，加抗鼠IgG抗體（1︰3 000，美國Santa Cruz生物技術(shù)公司）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯色，ImageQuantTM400凝膠成像系統(tǒng)（美國通用公司）分析蛋白表達(dá)情況。

1.8　半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3活性確定

采集肝組織樣本進(jìn)行均質(zhì)處理，10 000 r/min下離心10 s，持續(xù)3次，BCA試劑盒測定總蛋白。取50 μg蛋白于N-乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-對硝基苯胺（Ac-DEVD-pNA）中室溫下培育30 min，ELISA及分光光度計(jì)（波長405 nm）檢測半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-3吸光率。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)兩兩比較用完全隨機(jī)單因素方差分析及Tukey事后檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　EA對肝硬化小鼠的作用

血清標(biāo)本檢測顯示，肝硬化模型組小鼠血清ALT、AST、ALB水平較對照組明顯增高，EA干預(yù)5周后肝硬化小鼠 ALT、AST、ALB水平顯著下降（P＜0.05）（圖 1）。肝臟組織 HE 染色顯示，肝硬化模型組小鼠有明顯肝硬化細(xì)胞改變，EA能有效抑制肝硬化形成過程中細(xì)胞形態(tài)改變（P＜0.05）（圖2）。

圖1　各組小鼠血清ALT、AST、ALB水平

圖2　各組小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

2.2　EA對肝硬化小鼠Ⅰ型膠原蛋白的作用

RT-PCR檢測顯示，肝硬化模型組Ⅰ型膠原表達(dá)水平較對照組顯著升高，EA能顯著抑制Ⅰ型膠原表達(dá)水平（P＜0.05）（圖 3）。

圖3　各組小鼠Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平

2.3　EA對肝硬化小鼠iNOS蛋白表達(dá)的作用

蛋白印跡檢測顯示，肝硬化模型組小鼠肝臟iNOS蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，EA干預(yù)后iNOS 表達(dá)水平明顯受抑制（P＜0.05）（圖 4）。

2.4　EA對肝硬化小鼠氧化應(yīng)激的影響

ELISA檢測顯示，肝硬化模型組小鼠GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性水平均較對照組顯著抑制，EA干預(yù)5周后GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）（圖 5）。

2.5　EA對肝硬化小鼠ROS的影響

ROS檢測顯示，肝硬化模型組小鼠ROS水平與對照組相比顯著升高，EA干預(yù)后ROS水平顯著受抑制（P＜0.05）（圖 6）。

圖4　各組小鼠iNOS蛋白表達(dá)水平

圖5　各組小鼠GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性水平

圖6　各組小鼠ROS水平

2.6　EA對肝硬化小鼠VEGF、VEGFR-2的影響

蛋白印跡檢測顯示，肝硬化模型組VEGF、VEGFR-2表達(dá)水平與對照組相比顯著升高，EA干預(yù)后顯著抑制 VEGF、VEGFR-2 表達(dá)（P＜0.05）（圖 7）。

2.7　EA對肝硬化小鼠caspase-3活性的影響

ELISA檢測顯示，肝硬化模型組caspase-3活性與對照組相比顯著升高，EA干預(yù)能顯著降低caspase-3 活性水平（P＜0.05）（圖 8）。

圖7　各組小鼠VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平

圖8　各組小鼠caspase-3活性水平

3　討論

隨著病程進(jìn)展，肝纖維化常并發(fā)門靜脈高壓致上消化道出血，甚至有演變?yōu)楦伟┛赡堋ｋm然目前對肝硬化門靜脈高壓并發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血及肝癌均能采用介入治療，但對肝硬化尚無特殊介入治療方法。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肝損傷的一個重要因素，氧化應(yīng)激亢進(jìn)和抗氧化機(jī)制破壞，最終導(dǎo)致肝損傷［15］。ROS超載使細(xì)胞DNA受損，質(zhì)膜和胞內(nèi)重要的酶蛋白氧化，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡，如果受損DNA不能得到及時修復(fù)，會誘發(fā)突變致正常細(xì)胞癌變［16］。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在新陳代謝中產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，且能維持相對平衡。細(xì)胞內(nèi)存在的還原類物質(zhì)GSH和SOD可主動清除積累ROS［17］。正常情況下肝組織主要表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），iNOS無或僅有少量表達(dá)。iNOS在肝組織受到內(nèi)毒素（脂多糖）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（IFN）-lP等細(xì)胞因子刺激后表達(dá)增加，活性可持續(xù)較長時間，催化一氧化氮（NO）大量持續(xù)產(chǎn)生，介導(dǎo)廣泛的毒性作用［18］。在氧化應(yīng)激造成肝損傷中，iNOS表達(dá)與肝細(xì)胞壞死程度有關(guān)［19］。本研究表明，EA能抑制肝硬化小鼠iNOS蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)GSH-PX、GSH、SOD、MDA活性并抑制ROS形成。

VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在調(diào)節(jié)血管生成中具有重要作用［20］。近年研究表明，VEGF可誘導(dǎo)肝臟血管生成，促進(jìn)損傷肝細(xì)胞再生，同時因有強(qiáng)烈的微血管通透性，促進(jìn)急性炎性改變，引起血漿蛋白（包括纖維蛋白原）外滲并可凝集于血管外基質(zhì)，形成纖維蛋白，促進(jìn)肝硬化進(jìn)展［21-22］。但仍有實(shí)驗(yàn)證明，肝硬化小鼠肝部分切除術(shù)后，VEGF能積極促進(jìn)肝再生［23-25］。本研究提示，EA能明顯抑制肝硬化小鼠VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)。

Caspase-3是caspases家族成員之一，是細(xì)胞凋亡途徑末端底物酶解的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白酶，其被激活后將引起細(xì)胞凋亡［26］。caspase-3表達(dá)水平可代表機(jī)體組織細(xì)胞的凋亡水平［27-28］。本研究結(jié)果表明，EA顯著降低肝硬化小鼠中caspase-3活性。

EA對肝臟有保護(hù)作用，可抑制血清中ALT、AST、ALB水平和Ⅰ型膠原基因在肝硬化小鼠的表達(dá)。這些保護(hù)作用與抗氧化機(jī)制相關(guān)，即通過調(diào)節(jié)iNOS、VEGF和caspase-3表達(dá)，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，增加抗氧化酶而發(fā)揮作用；表明EA可能是一個潛在的新型藥物，可在急性低氧條件下通過iNOS、VEGF和caspase-3表達(dá)緩解肝硬化、保護(hù)肝臟。本研究是EA對肝硬化作用的基礎(chǔ)研究，未來將進(jìn)一步開展經(jīng)肝動脈插管灌注EA對肝硬化保護(hù)作用的動物試驗(yàn)研究［28］，為采用介入手術(shù)方式緩解肝硬化病程進(jìn)展提供理論依據(jù)。

［參 考 文 獻(xiàn)］

［1］王磊，劉福全，岳振東，趙洪偉.應(yīng)用介入技術(shù)建立豬肝硬化門脈高壓模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2012，21：756-759.

［2］Caprai S， Vajro P， Ventura A，et al.Autoimmune liver disease associated with celiac disease in childhood：a multicenter study［J］.Clin Gastroenterol Hepatol， 2008， 6： 803-806.

［3］Assy N，Kayal M，Mejirisky Y，et al.The changes in renal function after a single dose of intravenous furosemide in patients with compensated liver cirrhosis［J］.BMC Gastroenterol， 2006，6：39-43.

［4］Kuiper EM，Hansen BE，Lesterhuis W，et al.The long-term effect of ursodeoxycholic acid on laboratory liver parameters in biochemically non-advanced primary biliary cirrhosis［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol， 2011， 35： 29-33.

［5］Misik M，Hoelzl C，Wagner KH，et al.Impact of paper filtered coffee on oxidative DNA-damage： results of a clinical trial［J］.Mutat Res， 2010， 692： 42-48.

［6］Spahr L， Bresson-Hadni S， Amann P， et al.Allopurinol，oxidative stress and intestinal permeability in patients with cirrhosis： an open-label pilot study［J］.Liver Int， 2007， 27：54-60.

［7］Simon-Talero M，Garcia-Martinez R，Torrens M，et al.Effects of intravenous albumin in patients with cirrhosis and episodic hepatic encephalopathy： a randomized double-blind study［J］.J Hepatol， 2013， 59： 1184-1192.

［8］Deng G， Wang J， Zhang Q， et al.Hepatoprotective effects of phloridzin on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride against oxidative stress-triggered damage and fibrosis in rats［J］.Biol Pharm Bull， 2012， 35： 1118-1125.

［9］Fang H， Liu A， Dirsch O， et al.Liver transplantation and inflammation：is lipopolysaccharide binding protein the link?［J］.Cytokine， 2013， 64： 71-78.

［10］ Marotta F， Yoshida C， Barreto R， et al.Oxidative-inflammatory damage in cirrhosis：effect of vitamin E and a fermented papaya preparation［J］.J Gastroenterol Hepatol， 2007， 22： 697-703.

［11］ Modi M， Goel T， Das T， et al.Ellagic acid&gallic acid from LagerstroemiaspeciosaL.inhibitHIV-1 infectionthrough inhibition of HIV-1 protease&reverse transcriptase activity［J］.Indian J Med Res， 2013， 137： 540-548.

［12］ Ural MS， Yonar ME， Mise Yonar S.Protective effect of ellagic acid on oxidative stress and antioxidant status in Cyprinus carpio during malathion exposure［J］.Cell Mol Biol（Noisy-le-grand），2015， 61：58-63.

［13］ Mishra S， Vinayak M.Role of ellagic acid in regulation of apoptosis by modulating novel and atypical PKC in lymphoma bearing mice［J］.BMC Complement Altern Med， 2015， 15： 281

［14］ Zhang HM， Zhao L， Li H， et al.Research progress on the anticarcinogenic actions and mechanisms of ellagic acid ［J］.Cancer Biol Med，2014，11：92-100.

［15］ De Minicis S， Brenner DA.Oxidative stress in alcoholic liver disease： role of NADPH oxidase complex［J］.J Gastroenterol Hepatol， 2008， 23（Suppl 1）： S98-S103.

［16］ Oettl K， Stadlbauer V， Petter F， et al.Oxidative damage of albumin in advanced liver disease［J］.Biochim Biophys Acta，2008， 1782：469-473.

［17］ Vidali M，Occhino G，Ivaldi A，et al.Combination of oxidative stress and steatosis is a risk factor for fibrosis in alcohol-drinking patients with chronic hepatitis C［J］.Am J Gastroenterol， 2008，103：147-153.

［18］ Li J， Wang Y.Effect of different methods of hypoxic exercise training on free radical oxidation and antioxidant enzyme activity in the rat brain［J］.Biomed Rep， 2013， 1： 925-929.

［19］ Yan Z， Qu K， Zhang J， et al.CD147 promotes liver fibrosis progression via VEGF-A/VEGFR2 signalling-mediated cross-talk between hepatocytes and sinusoidal endothelial cells［J］.Clin Sci（Lond）， 2015， 129： 699-710.

［20］ Tekkesin N，Taga Y，Sav A，et al.Induction of HGF and VEGF in hepatic regeneration after hepatotoxin-induced cirrhosis in mice［J］.Hepatogastroenterology， 2011， 58： 971-979.

［21］ Kishta SA，Abd-Alhade AA，Hamam O，et al.Prognostic value of TNF a mRNA and VEGF mRNA expression in patients with chronic hepatitis C genotype-4，with and without cirrhosis and hepatocellular carcinoma to predict disease outcome［J］.J Egypt Soc Parasitol， 2010， 40： 515-530.

［22］ Jaroszewicz J， Januszkiewicz M， Flisiak R， et al.Circulating vascular endothelial growth factor and its soluble receptors in patients with liver cirrhosis：possible association with hepatic function impairment［J］.Cytokine， 2008， 44： 14-17.

［23］ Mukozu T， Nagai H， Matsui D， et al.Serum VEGF as a tumor markerinpatientswithHCV-related livercirrhosisand hepatocellular carcinoma［J］.Anticancer Res， 2013， 33： 1013-1021.

［24］ Surapaneni KM，Vishnu Priya V，Mallika J.Effect of pioglitazone，quercetin，and hydroxy citric acid on vascular endothelial growth factor messenger RNA（VEGF mRNA）expression in experimentally induced nonalcoholic steatohepatitis（NASH）［J］.Turk J Med Sci，2015，45：542-546.

［25］ Labrecque L， Lamy S， Chapus A， et al.Combined inhibition of PDGF and VEGF receptors by ellagic acid，a dietary-derived phenolic compound［J］.Carcinogenesis， 2005， 26： 821-826.

［26］ Izawa T， Horiuchi T， Atarashi M， et al.Anti-fibrotic role of miR-214 in thioacetamide-induced liver cirrhosis in rats［J］.Toxicol Pathol， 2015， 43： 844-851.

［27］ Liu C， Wang G， Chen G， et al.Huangqi decoction inhibits apoptosis and fibrosis，but promotes Kupffer cell activation in dimethylnitrosamine-induced rat liver fibrosis［J］.BMC Complement Altern Med，2012，12：51.

［28］初金哲，王黎洲，張帥，等.改良的經(jīng)大鼠胃十二指腸動脈逆行肝動脈插管實(shí)驗(yàn)研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2016，25：798-802.