吳　猛，　周如海，　袁　瑞，　趙　平，　方來福

乳腺癌是世界范圍內(nèi)影響女性生命健康的一大惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年升高［1］。近年來，隨著治療手段和藥物的進(jìn)展，乳腺癌患者的生存質(zhì)量有所提升［2］。但對(duì)于乳腺癌患者的準(zhǔn)確診斷和分期依然是影響癌癥患者預(yù)后的重要因素。乳腺癌的基因型分期對(duì)臨床患者的治療和預(yù)后判斷有著極其重要的價(jià)值［3-4］。浸潤(rùn)性小葉癌（invasive lobular carcinoma，ILC）是乳腺浸潤(rùn)性癌癥中的一種，占據(jù)所有乳腺癌患者的5%～15%［5］。觸診和乳腺X線照射難以診斷浸潤(rùn)性小葉癌，從而導(dǎo)致ILC患者發(fā)現(xiàn)自身癌癥病情時(shí)，腫瘤體積往往大于乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，極大地影響患者的治療［6］。研究報(bào)道，現(xiàn)階段對(duì)于ILC的診斷主要為彩色多普勒超聲診斷，但靈敏度和特異度有待提升［7］；超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（ultrasound-guided fine needle aspiration cytology，US-FNAC）發(fā)展迅速，作為一種微創(chuàng)而又高準(zhǔn)確度的診斷手段，備受臨床的關(guān)注［8］。已有報(bào)道顯示，US-FNAC已證實(shí)在甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中有較高的診斷價(jià)值［9］，與FNAC相比，另一種發(fā)展迅速的穿刺診斷技術(shù)，超聲引導(dǎo)粗針穿刺組織學(xué)（ultrasoundguided core needle biopsy，US-CNB）同樣發(fā)展迅速［10］。相關(guān)報(bào)道稱，由于粗針穿刺獲得的組織量更多，粗針穿刺的診斷效能要高于細(xì)針穿刺，可信度更高［11］；除此之外，粗針穿刺獲得的組織還可用于免疫組化檢測(cè)，而對(duì)于乳腺癌患者來說，雌激素（ER）、孕激素（PR）等基因蛋白的檢測(cè)有助患者病情及預(yù)后的診斷?，F(xiàn)階段，一方面乳腺癌超聲診斷研究更多的是浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，乳腺浸潤(rùn)性小葉癌的研究卻很少；另一方面乳腺癌細(xì)針穿刺診斷的研究報(bào)道較多，但細(xì)針穿刺由于穿刺物量較少，準(zhǔn)確度不夠，而粗針穿刺診斷ILC的研究也較少。綜上，本課題回顧性分析了乳腺癌浸潤(rùn)性小葉癌患者的臨床資料，探討US-CNB診斷可疑淋巴結(jié)的價(jià)值，旨在為臨床診斷ILC提供一種新的手段。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1研究對(duì)象患者來源于我院2014年1月—2016年12月經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)結(jié)果判定為乳腺浸潤(rùn)性小葉癌的患者，共納入71例患者，平均年齡為（50±7）歲，均為女性，其中8例患者存在雙側(cè)病變，超聲探查80處可疑淋巴結(jié)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①乳腺癌患者經(jīng)臨床病理學(xué)診斷判定為乳腺浸潤(rùn)性小葉癌；②患者術(shù)前均行彩色多普勒超聲、US-FNAC和USCNB檢查，且臨床資料完整者；③參與患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤或嚴(yán)重疾??；②年齡大于70歲。

納入存在術(shù)前US-CNB穿刺組織和術(shù)后切除腫瘤組織免疫組化結(jié)果的乳腺小葉癌患者共52例，并對(duì)比兩種方法檢測(cè)ER、PR、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER2）基因表達(dá)含量。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。表1。

表1　納入研究患者的基線信息

1.1.2實(shí)驗(yàn)器材Philips彩色超聲診斷儀（探頭頻率7.5～13 MHz）；普利賽PRE1810穿刺活檢針；10 mL一次性注射器；7號(hào)穿刺針（外徑0.7 mm）；ER、PR、HER2 一抗（美國(guó) Sigma）；甲醛、二甲苯、PBS 緩沖液、乙醇等。

1.2　研究方法

1.2.1彩色多普勒超聲檢查患者采取仰臥體位，雙手上舉充分暴露病變腋窩，由專業(yè)超聲科醫(yī)師進(jìn)行腋窩的超聲檢查，并記錄可疑淋巴結(jié)的超聲特征，滿足以下超聲特征時(shí)可認(rèn)定為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)［12］：①單個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)聚集，邊界粗糙、不規(guī)整，多圓形；②可見斷斷續(xù)續(xù)的被膜；③可見分葉狀或偏心的皮質(zhì)，出現(xiàn)大于2 mm的偏心或同心的增厚；皮、髓質(zhì)分界不清且回聲低，或見小梁回聲；④彩色多普勒可見皮、髓質(zhì)區(qū)血流信號(hào)豐富，可見小動(dòng)脈。超聲診斷后，由專業(yè)醫(yī)師對(duì)可疑淋巴結(jié)進(jìn)行進(jìn)一步得US-FNAC和US-CNB檢查。

1.2.2US-FNAC細(xì)胞學(xué)檢測(cè)患者采取平臥位，根據(jù)可疑淋巴結(jié)位置選取合適穿刺點(diǎn)，并用2%利多卡因表面麻醉，待消毒處理后，在超聲引導(dǎo)下，將7號(hào)穿刺針刺入可疑淋巴結(jié)內(nèi)部，可行針尖進(jìn)退或旋轉(zhuǎn)多次，以獲取足夠的穿刺物，后將針頭中的穿刺物轉(zhuǎn)移至載玻片上涂抹，待晾干后95%乙醇固定，并行HE染色和鏡檢。以鏡下出現(xiàn)癌細(xì)胞判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.3US-CNB活檢患者采取平臥位，雙手抬起充分暴露穿刺部位，采用RE1810穿刺活檢針，穿刺前根據(jù)實(shí)時(shí)超聲確定穿刺點(diǎn)和進(jìn)針路線，予穿刺部位麻醉和消毒處理后，借由手術(shù)刀片在穿刺點(diǎn)切下一小切口，保證順利進(jìn)針，在超聲引導(dǎo)下，穿刺針沿探頭長(zhǎng)軸方向刺入至淋巴結(jié)邊緣，后激發(fā)穿刺針的活檢針，采取組織條，并送往病理科進(jìn)行組織學(xué)診斷。以病理報(bào)告為惡性淋巴結(jié)判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.4免疫組化檢測(cè)石蠟包埋：甲醛固定組織標(biāo)本后，進(jìn)行石蠟包埋處理。脫蠟：載玻片浸入二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10 min。水化：載玻片分別浸入100%、95%、75%乙醇中各浸泡5 min，PBS溶液沖洗凈后晾干。抗原修復(fù)：修復(fù)液加熱至沸騰，將載玻片浸入加熱2 min，冷卻后洗凈。滅活：載玻片浸入雙氧水溶液中，室溫孵育10 min，取出后沖洗干凈。一抗孵育：將一抗滴加至載玻片上，置于4℃孵育過夜。增強(qiáng)：載玻片洗凈后，滴加聚合物增強(qiáng)劑，孵育20 min。二抗孵育：沖洗干凈后，室溫孵育30 min。顯色：滴加顯色液，于顯微鏡下觀察；蘇木素復(fù)染；酸化和返藍(lán)。封片：梯度乙醇脫水后，用中性樹膠封片。

1.2.5ER、PR陽(yáng)性判定ER、PR定位于細(xì)胞膜，參考ASCOCAP共同制定的《乳腺癌雌激素/孕激素受體免疫組化檢測(cè)指南》［13］判定，ER及PR陽(yáng)性染色必須是定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)上，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，若細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒不足以證實(shí)陽(yáng)性。

1.2.6HER2陽(yáng)性判定HER2定位于細(xì)胞膜，參考 ASCOCAP 共同制定的指南［14］：1+，＞10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱或難以察覺的細(xì)胞膜染色。2+，＞10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整和/或微弱～中強(qiáng)度細(xì)胞膜染色或≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完整的細(xì)胞膜強(qiáng)陽(yáng)性染色；3+，＞10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完整的細(xì)胞膜強(qiáng)染色。以上判定均由2名高資歷的醫(yī)師共同判定，結(jié)果一致判定為陽(yáng)性。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡，BMI，長(zhǎng)、短直徑及之比為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；病變部位、彩色多普勒超聲、US-FNAC、US-CNB 以及 ER、PR、HER2 陽(yáng)性判斷結(jié)果數(shù)為計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)表示；US-CNB與常規(guī)超聲、US-FNAC的診斷靈敏度比較采用卡方檢驗(yàn)，US-CNB獲取組織與術(shù)后腫瘤組織免疫組化結(jié)果檢測(cè)ER、PR、HER2基因靈敏度的比較采用采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　臨床超聲及US-FNAC和US-CNB穿刺結(jié)果

彩色多普勒超聲顯示可疑淋巴結(jié)，邊界粗糙、不規(guī)整，回聲低（圖1①）；US-FNAC細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示，可疑淋巴結(jié)中出現(xiàn)細(xì)胞核染色較深的癌細(xì)胞（圖1②）；US-CNB病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)HE染色后，鏡下出現(xiàn)細(xì)胞核深度染色的癌細(xì)胞（圖1③）。

圖1　淋巴結(jié)穿刺超聲和病理表現(xiàn)

2.2　超聲及US-FNAC和US-CNB診斷ILC腋窩可疑淋巴結(jié)的靈敏度、特異度比較

與常規(guī)超聲相比，US-CNB的靈敏度、特異度、約登指數(shù)均有所升高，經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，靈敏度差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1＝0.015）；與US-FNAC相比，US-CNB的靈敏度、特異度、約登指數(shù)均有所升高，經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，靈敏度、特異度的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＞0.05）。 （表 2）

2.3　超聲引導(dǎo)下粗針穿刺物免疫組織化學(xué)診斷ER、PR及HER2表達(dá)情況

US-CNB所得穿刺物免疫組化結(jié)果顯示，ER、PR陽(yáng)性標(biāo)本鏡下出現(xiàn)細(xì)胞核染色標(biāo)本，HER2陽(yáng)性標(biāo)本鏡下出現(xiàn)細(xì)胞膜染色標(biāo)本。（圖2）。

表2　超聲及US-FNAC、US-CNB診斷可疑淋巴結(jié)診斷效能的比較　%

US-CNB免疫組化結(jié)果顯示，診斷ER、PR、HER2陽(yáng)性標(biāo)本的靈敏度、特異度均可達(dá)90%以上；與術(shù)后切除腫瘤標(biāo)本免疫組織化學(xué)結(jié)果相比，經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，兩者之間診斷基因陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 （表 3）。

圖2　ER、PR和HER2鏡下表達(dá)

表3　US-CNB免疫組織化學(xué)診斷ER、PR、HER2陽(yáng)性標(biāo)本的效能　%

3　討論

乳腺浸潤(rùn)性小葉癌是乳腺常見的一種腫瘤，近年來發(fā)病率不斷上升［15］，相關(guān)報(bào)道顯示，彩色多普勒超聲已用于臨床多種疾病的診斷［8，16］，而與之相關(guān)的超聲引導(dǎo)下細(xì)針和粗針穿刺也可幫助診斷癌癥轉(zhuǎn)移性可疑淋巴結(jié)［10，17］，已有研究證實(shí)超聲引導(dǎo)下穿刺活檢對(duì)乳腺癌的轉(zhuǎn)移有一定的診斷價(jià)值［18］，粗針穿刺下的組織活檢相比于細(xì)針穿刺的細(xì)胞學(xué)檢查更有優(yōu)勢(shì)，US-CNB獲得的標(biāo)本量更多，診斷的靈敏度和特異度均有提升，此外，粗針穿刺獲得標(biāo)本還可用于免疫組化檢測(cè)，可以輔助臨床乳腺癌患者基因表型的診斷。ER、PR和HER2對(duì)乳腺癌的治療方式以及患者的預(yù)后判斷均有著重要的提示作用。因此，臨床上對(duì)乳腺癌患者腫瘤標(biāo)本中ER、PR、HER2 3種基因蛋白的表達(dá)情況十分關(guān)注［19-20］。本課題通過收集乳腺浸潤(rùn)性小葉癌患者的臨床資料，旨在探討US-CNB對(duì)診斷患者轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)以及乳腺癌相關(guān)基因的效能。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于單獨(dú)的多普勒超聲，US-CNB診斷轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的靈敏度和特異度更高，分別為85%和92%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與高效率的US-FNAC相比，US-CNB的靈敏度和特異度仍有所上升，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能是由于病例數(shù)不足。本研究結(jié)果表明US-CNB有著更理想的診斷準(zhǔn)確度，提示可以臨床可采用多采用US-CNB方法輔助診斷小葉癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

此外，我們還通過免疫組化方法比較了US-CNB和術(shù)后腫瘤組織中ER、PR以及HER2 3種基因蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)，US-CNB評(píng)價(jià)患者基因表達(dá)的靈敏度和特異度均可達(dá)95%以上，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者診斷基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的差異顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，充分表明US-CNB組織標(biāo)本免疫組化結(jié)果診斷基因蛋白表達(dá)情況的效率可比擬術(shù)后腫瘤標(biāo)本免疫組化結(jié)果診斷的效率，提示US-CNB組織免疫組化可輔助臨床診斷患者腫瘤中基因表達(dá)情況，當(dāng)考慮到US-CNB的高效性，可為臨床腫瘤患者的治療和預(yù)后評(píng)估提供極大的便利。

然而，本研究中仍有許多不足，一方面我們收集的病例數(shù)不多，另一方面研究顯示US-FNAC和US-CNB在現(xiàn)階段的操作和判定標(biāo)準(zhǔn)在不同的時(shí)間和地點(diǎn)差異較大，這對(duì)我們的研究結(jié)果也有著一定的影響。

綜上，我們的研究結(jié)果表明US-CNB組織活檢和免疫組織化學(xué)方法可以輔助臨床診斷乳腺小葉癌患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)以及ER、PR、HER2 3種基因蛋白的表達(dá)情況。

［參 考 文 獻(xiàn)］

［1］Tao Z， Shi A， Lu C， et al.Breast cancer： epidemiology and etiology［J］.Cell Biochem Biophys， 2015， 72： 333-338.

［2］Reddy JP，Dawood S，Mitchell M，et al.Antiepileptic drug use improves overall survival in breast cancer patients with brain metastases in the setting of whole brain radiotherapy［J］.Radiother Oncol， 2015， 117： 308-314.

［3］Thakkar JP， Mehta DG.A review of an unfavorable subset of breast cancer：estrogen receptor positive progesterone receptor negative［J］.Oncologist， 2011， 16： 276-285.

［4］Seo AN， Lee HJ， Kim EJ， et al.Expression of breast cancer stem cell markers as predictors of prognosis and response to trastuzumab in HER2-positive breast cancer［J］.Br J Cancer，2016， 114：1109-1116.

［5］Stivalet A， Luciani A， Pigneur F， et al.Invasive lobular carcinoma of the breast：MRI pathological correlation following bilateral total mastectomy［J］.Acta Radiol， 2012， 53： 367-375.

［6］Arpino G， Bardou VJ， Clark GM， et al.Infiltrating lobular carcinoma of the breast：tumor characteristics and clinical outcome［J］.Breast Cancer Res， 2004， 6： R149-R156.

［7］Evans WP， Warren Burhenne LJ， Laurie L， et al.Invasive lobular carcinoma of the breast：mammographic characteristics and computer-aided detection［J］.Radiology， 2002， 225： 182-189.

［8］Pavel G， Malancus R， Condrea M.Fine needle aspiration cytology （FNAC）of neoplasms in dogs and cats，with emphasis on differential diagnosis： a retrospective study［J］.Bulletin UASVM Veterinary Medicine，2016，73：116-126.

［9］Rossi ED， Bizzarro T， Martini M， et al.The evaluation of miRNAs on thyroid FNAC：the promising role of miR-375 in follicular neoplasms［J］.Endocrine， 2016， 54： 723-732.

［10］Kim YH，Kwon HJ，Kim EK，et al.Applying ultrasound-guided core needle biopsy for diagnosis of thyroid masses：preliminary results from a single institution［J］.J Ultrasound Med， 2015，34：1801-1808.

［11］Suh CH，Baek JH，Lee JH，et al.The role of core-needle biopsy in the diagnosis of thyroid malignancy in 4580 patients with 4746 thyroid nodules：a systematic review and meta-analysis［J］.Endocrine， 2016， 54： 315-328.

［12］郭萬學(xué).超聲醫(yī)學(xué)［M］.第6版，北京：人民軍醫(yī)出版社，2011.

［13］Hammond ME，Hayes DF，Dowsett M，et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer［J］.Arch Pathol Lab Med，2010，134：e48-e72.

［14］Lambein K，Van Bockstal M，Denys H，et al.2013 update of the American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline for human epidermal growth factor receptor 2 testing：impact on immunohistochemistry-negative breast cancers［J］.J Clin Oncol， 2014， 32： 1856-1857.

［15］ Fan L， Strasser-Weippl K， Li JJ， et al.Breast cancer in China［J］.Lancet Oncol， 2014， 15： e279-e289.

［16］張婭梅，王書智，顧建平，等.彩色多普勒超聲診斷下肢靜脈疾病的臨床價(jià)值——與DSA比較研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2009，18：904-907.

［17］Kunte C，Schuh T，Eberle JY，et al.The use of high-resolution ultrasonographyforpreoperativedetectionofmetastasesin sentinel lymph nodes of patients with cutaneous melanoma ［J］.Dermatol Surg， 2009， 35： 1757-1765.

［18］王娟，王蔚蔚，魏春紅，等.超聲引導(dǎo)下穿刺活檢診斷乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［J］.臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志，2013，15：203-204.

［19］ Howat WJ， Blows FM， Provenzano E， et al.Performance of automated scoring of ER， PR， HER2， CK5/6 and EGFR in breast cancer tissue microarrays in the Breast Cancer Association Consortium［J］.J Pathol Clin Res， 2015， 1： 18-32.

［20］Sakurai M，Masuda M，Miki Y，et al.Correlation of miRNA expression profiling in surgical pathology materials， with Ki-67，HER2， ER and PR in breast cancer patients［J］.Int J Biol Markers， 2015， 30： e190-e199.