陸　敏　孫湖泊　李　妍　王長文　

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林　吉林　132013)

1北京體育大學(xué)附屬醫(yī)院

納米顆粒的粒徑極小，可以順利通過生物膜而進(jìn)入機(jī)體的組織細(xì)胞，并進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，最終引起細(xì)胞代謝紊亂或基因表達(dá)異常〔1～3〕。Duan等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化硅是誘發(fā)心血管疾病的危險(xiǎn)因素；龔春梅等〔5〕進(jìn)一步證實(shí)了納米二氧化硅對(duì)機(jī)體的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)擬檢測納米二氧化硅對(duì)大鼠肝、腎的影響及秋梨膏的干預(yù)效果。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)為2011-x-072。隨機(jī)將大鼠分為3組，每組8只，對(duì)照組采取灌胃生理鹽水及氣管滴注生理鹽水處理；染毒組灌胃生理鹽水，并給予氣管滴注納米二氧化硅，濃度10 mg·kg-1·bw-1；秋梨膏干預(yù)組在氣管滴注納米二氧化硅的同時(shí)，灌胃秋梨膏(0.225 ml/只)。每組大鼠均隔日氣管滴注，共進(jìn)行15次。非氣管滴注日進(jìn)行灌胃。處理結(jié)束后麻醉大鼠，并迅速取出肝及腎，稱重并逐項(xiàng)檢測。

1.2主要試劑秋梨膏，北京恩濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn)；粒徑50 nm的納米二氧化硅購自阿拉丁生物制品有限公司；羥脯氨酸(HYP)試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗體由美國Abcam生物科技公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3大鼠尿常規(guī)檢測各組大鼠處死時(shí)從膀胱抽取尿液，檢測尿隱血、亞硝酸鹽、尿膽原、尿膽紅素、尿葡萄糖等尿常規(guī)指標(biāo)。

1.4肝、腎組織HYP含量檢測準(zhǔn)確稱取肝、腎組織后，加入水解液中混勻，沸水浴水解，按照HYP含量測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算肝及腎組織中HYP含量。HYP的含量反映了組織中膠原纖維的含量，是特異性判斷組織早期纖維化相關(guān)性的重要指標(biāo)，Masson染色藍(lán)染的部分即為膠原纖維。

1.5免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)染色法檢測肝、腎細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)情況。肝、腎組織切片后分別經(jīng)過抗原修復(fù)后按照免疫組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察切片。對(duì)照組細(xì)胞核呈藍(lán)色且深染，而表達(dá)陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，計(jì)數(shù)每個(gè)400倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1大鼠尿常規(guī)指標(biāo)檢測硅染毒組大鼠尿隱血(6例)、尿膽原+(8例)、尿膽紅素+(8例)明顯高于對(duì)照組(均0例)，而秋梨膏干預(yù)可有效改善大鼠尿隱血(0例)及尿膽紅素(+0例)異?，F(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但秋梨膏對(duì)納米二氧化硅染毒大鼠的尿膽原(+8例)升高沒有緩解作用(P>0.05)。

2.2大鼠肝、腎組織蘇木素-伊紅(HE)染色結(jié)果顯微鏡下觀察對(duì)照組大鼠的肝組織切片，可見肝細(xì)胞的形態(tài)正常，細(xì)胞膜及核膜完整，中央靜脈形態(tài)正常。染毒組大鼠肝組織中可見淋巴細(xì)胞浸潤，形成肉芽腫，肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣變性。與對(duì)照組大鼠腎組織相比，染毒組腎小管管腔因水腫而狹窄，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生水樣變性，腎小球充血。秋梨膏干預(yù)組大鼠的肝、腎病理變化與對(duì)照組相比均明顯減輕。見圖1。

圖1　秋梨膏對(duì)納米二氧化硅染毒大鼠肝、腎組織形態(tài)的影響(HE，×400)

2.3HYP含量檢測對(duì)照組、染毒組及秋梨膏干預(yù)組大鼠肝(103.57、92.52、86.22 μg/g)、腎(93.37、102.38、91.84 μg/g)HYP的含量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2　各組大鼠肝、腎Masson染色照片(Masson，×400)

2.4TGF-β1表達(dá)檢測秋梨膏干預(yù)組大鼠腎組織中TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)(143.50個(gè))明顯高于對(duì)照組(1.50個(gè))和染毒組(1.75個(gè)，P<0.01)，肝組織中(1.25個(gè))與對(duì)照組(3.50個(gè))和染毒組(0.75個(gè))差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3　各組大鼠肝、腎TGF-β1表達(dá)的免疫組化照片(×400)

3　討　論

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米二氧化硅的粒徑及細(xì)胞的種類是影響其毒性的關(guān)鍵因素〔6〕。Rabolli等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化硅顆粒對(duì)J774巨噬細(xì)胞、EAHY926 內(nèi)皮細(xì)胞、3t3 纖維母細(xì)胞和人類紅細(xì)胞的毒性作用機(jī)制及毒性效應(yīng)并不相同。本研究結(jié)果表明，納米二氧化硅可引起大鼠肝、腎細(xì)胞的明顯水腫，提示一定粒徑的納米二氧化硅對(duì)肝腎組織均有損傷作用。

秋梨膏是我國一直廣泛使用的傳統(tǒng)藥膳膏劑，其潤肺止咳、清熱化痰的效果受到廣大人民群眾的普遍認(rèn)可，但秋梨膏的藥理作用目前尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秋梨膏可明顯抑制大鼠尿隱血及尿膽紅素異常增高現(xiàn)象，并明顯緩解納米二氧化硅對(duì)肝、腎組織的毒性作用，減輕肝腎細(xì)胞損傷。另外與對(duì)照組相比，毒組及秋梨膏干預(yù)組大鼠肝、腎組織中膠原纖維含量均未發(fā)生變化，這可能是因?yàn)榧{米二氧化作用時(shí)間較短，并未引起病變組織中膠原纖維的代償性增加。

TGF-β家族成員包括TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。研究表明〔8〕，TGF-β在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、免疫等方面具有重要的生物學(xué)作用。其中，TGF-β1主要由內(nèi)皮細(xì)胞和結(jié)締組織產(chǎn)生，是組織損傷及器官修復(fù)過程中的核心調(diào)控分子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明給予秋梨膏可能誘導(dǎo)大鼠腎組織中TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的過量表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，納米二氧化硅可引起大鼠肝、腎組織的明顯損傷，秋梨膏可有效抑制納米二氧化硅的毒性作用，但秋梨膏對(duì)納米二氧化硅引起的肝、腎組織損傷調(diào)控機(jī)制有所不同，其具體的分子機(jī)制有待深入研究。

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5龔春梅，楊亞蕊，周繼昌，等.維生素E對(duì)納米二氧化硅誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 〔J〕.職業(yè)與健康，2016；32(7)：902-5.

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