戴　慶　何　軍　張　凡　戴榮峰　韓　艷　蔣　琳

(常州市第三人民醫(yī)院急診科，江蘇　常州　213001)

1常州市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科

橋本甲狀腺炎(HT)是一種臨床常見的引起甲狀腺功能減退的自身免疫性疾病，具有早期癥狀不明顯、發(fā)展緩慢和病程長等特點(diǎn)。HT的發(fā)病人群多集中在30～50歲，且女性的發(fā)病率明顯高于男性〔1〕。研究認(rèn)為HT發(fā)病與機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂、甲狀腺內(nèi)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子浸潤等密切相關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清晰〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺分泌的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-14、IL-17和IL-23等在HT患者外周血中的表達(dá)增高，可能參與HT的機(jī)體免疫紊亂過程〔3～5〕。但有關(guān)IL-1β在HT患者外周血中的表達(dá)研究較少。本研究擬分析IL-1β在HT外周血中的表達(dá)及其與抗甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)和抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1對(duì)象和試劑收集2015年7月至2016年3月在常州市第三人民醫(yī)院確診為HT的患者20例為HT組，其中男4例，女16例，平均年齡(46.12±18.65)歲。經(jīng)臨床診斷及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證實(shí)，行甲狀腺細(xì)針穿刺活檢確診。收集同期健康體檢者20人為對(duì)照組，其中，男5人，女15人，平均年齡(42.86±12.28)歲。所有研究對(duì)象排除妊娠或哺乳期、腫瘤病史、腎功能不全、感染性疾病和糖尿病等其他自身免疫性疾病，且近期未使用免疫抑制劑等影響甲狀腺功能的藥物。

Trizol試劑購于中國大連寶生物技術(shù)有限公司，AB2720型PCR儀購于美國Thermo公司，羅氏Cobase 601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購于日本瑞士羅氏公司，二喹啉甲酸(BCA)總蛋白檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒均購于北京碧云天生物有限公司。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)鼠源單抗、IL-1β單克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗均購于美國Santa cruz公司。

1.2標(biāo)本收集研究對(duì)象均于晨起收集10 ml空腹肘靜脈血，分別于滅菌的含肝素抗凝管和非抗凝真空管中存放5 ml?？鼓苎獦犹幚矸椒ǎ翰捎镁壅崽欠河捌习访芏忍荻入x心法(Ficoll)分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞；非抗凝真空管血樣處理方法：室溫條件下自行凝固1 h后，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，EP管收集上清液，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)時(shí)熒光定量(Real Time)PCR檢測(cè)IL-1β mRNA表達(dá)收集對(duì)照組和HT組外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行Real Time PCR。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算IL-1β mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4Western印跡檢測(cè)IL-1β蛋白表達(dá)取對(duì)照組和HT組外周血單個(gè)核細(xì)胞，以單去污裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)其濃度。以每孔50 μg蛋白樣品在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜。37℃下以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入鼠抗人β-actin和IL-1β單克隆抗體(1∶500倍稀釋)，4℃孵育過夜，再加入HRP-山羊抗兔IgG(1∶1 000倍稀釋)，37℃下孵育2 h。以化學(xué)發(fā)光法顯色，Bio-Rad系統(tǒng)掃描分析目的蛋白的表達(dá)量。以IL-1β灰度值/β-actin灰度值表示IL-1β表達(dá)水平。

1.5電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清中TgAb和TPOAb水平取解凍后的血清，采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清中TgAb和 TPOAb水平，采用羅氏Cobas e601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。所有操作步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2　結(jié)　果

2.1兩組外周血中IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)對(duì)照組IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平(0.06±0.02，0.21±0.06)明顯低于HT組(1.12±0.26，1.55±0.42；均P<0.05)。見圖1。

圖1　Western印跡檢測(cè)結(jié)果

2.2IL-1β水平與TgAb和TPOAb的相關(guān)性HT患者血清中TgAb和TPOAb表達(dá)水平分別為(368.72±132.48)U/ml和(995.82±289.93 )U/ml。IL-1β表達(dá)水平與TgAb、TPOAb均呈正相關(guān)(r=0.679、0.745，P=0.001、0.000)。

3　討　論

IL-1是一種關(guān)鍵的致炎細(xì)胞因子。IL-1β是IL-1家族中的一種異構(gòu)形式，是由活化的單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)和促炎細(xì)胞因子。IL-1β由炎性體半胱天冬酶(Caspase)-1激活分子活性，參與病原體等多種相關(guān)分子產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β與糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)〔4〕。Yan等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，通過靶向IL-1β和IL-1受體拮抗劑間失衡，能達(dá)到改善糖尿病小鼠角膜上皮愈合延遲的作用。Li等〔7〕在評(píng)估m(xù)iR-155與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中的腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β異常表達(dá)的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155的靶點(diǎn)SOCS1可上調(diào)TNF-α和IL-1β表達(dá)。雷洪濤等〔8〕指出阿爾茨海默病血液和腦脊液中 IL-1β、TNF-α水平升高，在介導(dǎo)腦組織炎癥病理反應(yīng)中具有重要作用。

TgAb是一種甲狀腺濾泡柱狀細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白，TPOAb是一類分布在甲狀腺細(xì)胞頂緣和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜的結(jié)合糖蛋白，血清中高滴度的TgAb和TPOAb是HT患者的主要特征〔9〕。TgAb和TPOAb作為機(jī)體免疫功能紊亂的標(biāo)志，通過與抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，使甲狀腺組織受損，與HT的發(fā)病密切相關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β的高表達(dá)與HT的自身免疫活動(dòng)有關(guān)。IL-1β在HT患者外周血中的表達(dá)增高，可能在HT的發(fā)病過程中起重要作用。

1石曉靜,殷佩浩.橋本甲狀腺炎的治療研究進(jìn)展〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014;9(10):1142-4.

2高瑩,劉明明,修瑞娟.橋本甲狀腺炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制進(jìn)展〔J〕.內(nèi)科理論與實(shí)踐,2013;8(6):392-6.

3劉安寧，黃晶.覆蓋本甲狀腺炎患者外周血IL-14的表達(dá)及意義〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016;26(2):254-6.

4Esfahanian F,Ghelich R,Rashidian H,etal.Increased levels of serum interleukin-17 in patients with Hashimoto′s thyroiditis〔J〕.Indian J Endocrinol Metab,2017;21(4):551.

5Ruggeri RM,Saitta S,Cristani M,etal.Serum interleukin-23 (IL-23) is increased in Hashimoto′s thyroiditis〔J〕.Endocr J,2014;61(4):359-63.

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8雷洪濤,王筠,馬淑驊,等.IL-1β、TNF-α與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(24):7115-7.

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10Tomisti L,Urbani C,Rossi G,etal.The presence of anti-thyroglobulin (TgAb) and/or anti-thyroperoxidase antibodies (TPOAb) does not exclude the diagnosis of type 2 amiodarone-induced thyrotoxicosis〔J〕.J Endocrinol Invest,2016;39(5):585-91.