任曉麗，常宏建，趙冰冰，肖 敏，劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院黑龍江省重點實驗室/實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

乳腺腫瘤是全世界范圍內(nèi)嚴重威脅女性生命和健康的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐漸升高的趨勢。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(http://www.iarc.fr/)報道，在2012年，170萬婦女被診斷患有乳腺癌，在過去5年中630萬女性被診斷患有乳腺癌，2012年因乳腺瘤死亡522 000人[1]。犬乳腺腫瘤是一種發(fā)生于母犬的自發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率約是女性的3倍，病理組織學(xué)診斷約50%為惡性腫瘤，其分子表型和生物學(xué)特征與人類乳腺腫瘤相似，適合作為研究人類乳腺腫瘤的模型[2]。乳腺腫瘤具有異質(zhì)性，基于不同的基因表達譜，分為不同亞型，腫瘤轉(zhuǎn)移擴散是造成患者死亡的主要原因。microRNA(miRNA)是正常和異常生物過程(包括癌癥)中調(diào)控機體mRNA表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，miRNA的失調(diào)發(fā)生在各種類型的癌癥中，與腫瘤發(fā)生、耐藥性和轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。因此，基于調(diào)節(jié)miRNA表達水平和鑒定其靶標是乳腺癌早期診斷的有力依據(jù)。本文主要總結(jié)miRNA在乳腺腫瘤發(fā)展中的主要功能，并討論調(diào)控miRNA表達和檢測miRNAs水平的臨床應(yīng)用。

1 miRNA的生物合成和功能

miRNA是一類進化上高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，大小為18 nt～23 nt，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達。大部分的miRNA主要通過RNA聚合酶Ⅱ作用被轉(zhuǎn)錄成莖環(huán)樣結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，很少一部分由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄。細胞核內(nèi)的初級pri-miRNA在Drosha酶(RNase Ⅲ酶)及其輔助因子DGCR8作用下被剪接，修飾成70 nt～100 nt的pre-miRNAs(pre-miRNAs也可以通過mirtron途徑產(chǎn)生；通過核轉(zhuǎn)運受體(Exportin-5：Ran依賴性核轉(zhuǎn)運受體家族的成員)將Pre-miRNA轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，在Dicer和TRBP或ADR1作用下，將Pre-miRNA進一步切割成大約22 nt的不完全互補配對的雙鏈RNA；成熟miRNA的功能鏈被并入含有GW182和AGO蛋白的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，作為該復(fù)合物的一部分，成熟的miRNA調(diào)節(jié)基因表達通過與靶mRNA的3′UTR或5′UTR中的部分互補序列結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解，翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄激活[4-5]；例如，Liu M等[6]發(fā)現(xiàn)嵌入基因的miR-483-5p直接與胰島素樣生長因子2(IGF2)基因的5′UTR結(jié)合并誘導(dǎo)其在人腎母腫瘤中的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制。

2 miRNA常用的檢測方法及驗證方法

2.1 miRNA的檢測方法

2.1.1 RT-qPCR RT-qPCR方法是目前臨床上檢測腫瘤樣本miRNA表達量最常用的方法，分為莖環(huán)法、polyA加尾法。其主要差別在于RT-qPCR之前的cDNA制備過程，兩步法是通過獨特設(shè)計的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物進行反轉(zhuǎn)錄將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。而polyA加尾法是利用反轉(zhuǎn)錄過程將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并加上獨特設(shè)計的尾部序列。莖環(huán)法的優(yōu)勢是特異性高，miRNA 3′序列易出現(xiàn)多樣化現(xiàn)象，影響檢測準確性。而polyA加尾法則不受這一現(xiàn)象的影響，polyA加尾法的特異性如今已經(jīng)可以和莖環(huán)法媲美，成本低[7]。

2.1.2 Northern blot Northern blot是被譽為檢測miRNA的經(jīng)典方法，其原理是通過尿素變性凝膠電泳的方法，根據(jù)大小進行片段分離，將與目的miRNA互補的標記的探針雜交到硝酸纖維素膜或尼龍膜上顯影檢測。檢測結(jié)果可同時用于miRNA表達水平的定量檢測和用于區(qū)分miRNA前體與成熟體的位置。地高辛和鎖核苷酸是常用的探針標記，其優(yōu)點是鑒定miRNA的分子量大小，并可以顯示多個miRNA的分子量大小及濃度；缺點是操作繁瑣，靈敏度低；同時miRNA不易結(jié)合于固相雜交膜上，耗費大量RNA樣本，敏感性低；還會增加RNA酶容易降解的風險[7]。

2.1.3 高通量技術(shù) 基因芯片技術(shù)興起于20世紀90年代，其優(yōu)勢是具有極高的檢測通量，檢測成本較低，但是基因芯片只能顯示出2倍以內(nèi)的表達差異，屬于定性半定量檢測技術(shù)。Small RNA測序是一種最新的高通量測序技術(shù)，采用膠分離技術(shù)，收集樣品中18 nt～30 nt RNA片段，利用高通量測序技術(shù)，一次性獲得單堿基分辨率的數(shù)百萬條小RNA序列信息，依托生物學(xué)信息分析技術(shù)，鑒定已知小miRNA并預(yù)測新的miRNA及其靶基因，增加了新miRNA發(fā)現(xiàn)率。技術(shù)優(yōu)勢包括：①通量高。一次測序得到500萬條以上的序列；②分辨率高?？梢詸z測小 RNA單個堿基的差異；③精準度高。從幾個到數(shù)十萬個拷貝精確計數(shù)；④不依賴已知信息。既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現(xiàn)新小RNA；⑤可重復(fù)性高。深度測序保證了抽樣隨機性，重復(fù)性非常好。但該技術(shù)價格昂貴，對miRNA樣本處理要求較高，且隨著讀長增加，熒光信號逐漸減弱，堿基準確性會逐漸降低，使得深度測序讀長受到一定限制[8]。

2.2 miRNA-靶標相互作用驗證

目前，已經(jīng)開發(fā)了許多驗證miRNA-mRNA相互作用的實驗技術(shù)。一般來說，使用miRNA模擬物或miRNA抑制劑寡核苷酸或構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染，在蛋白質(zhì)水平上通過蛋白質(zhì)印跡和mRNA水平通過RT-qPCR(攜帶具有靶基因的特異性探針)方法獲得靶基因的差異miRNA表達的影響，缺點是不能區(qū)分miRNA靶標直接和間接相互作用。

2.2.1 螢光素酶測定 熒光素酶測定通常用于研究與其他細胞事件相關(guān)的基因表達，例如受體活性或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。螢火蟲熒光素酶測定被廣泛用于分析miRNA-mRNA直接的相互作用，原理是利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞，將模擬物miRNA或抑制劑miRNA轉(zhuǎn)入細胞中，檢測熒光素酶活性的高低判斷miRNA和靶基因的3′UTR的之間的作用程度，通常將Renilla(REN)熒光素酶用作發(fā)光標準化的參考基因。該方法優(yōu)勢在于報告物活性在翻譯后立即產(chǎn)生，測定非?？焖俸挽`敏，并且在宿主細胞及檢測試劑中沒有熒光背景。缺點是費時，價格昂貴，僅對于選擇用于克隆的3′UTR敏感，并且難以用于轉(zhuǎn)染[9]。

2.2.2 RISC免疫沉淀 RISC的免疫沉淀反應(yīng)(如AGO和TNRC6)能直接識別和分離miRNA靶標復(fù)合物的生物化學(xué)方法。該方法能獲得低豐度和短暫的miRNA-mRNA對。miRNA調(diào)控的靶mRNA與RISC一起進行免疫沉淀反應(yīng)，并通過RT-qPCR、微陣列或深度測序等方法進行分析。整個復(fù)合體的連續(xù)斷開依賴于miRNA靶標復(fù)合物和RISC之間的強相互作用以及所用抗體能沉淀AGO2(核心RISC蛋白通常用于復(fù)合免疫沉淀反應(yīng))。一些公司已經(jīng)開發(fā)出RISC蛋白亞基的顯性負突變體，以將miRNA靶標復(fù)合體捕獲到RISC中，從而限制進一步的處理，這種方法可以恢復(fù)瞬時和低豐度mRNA靶標，否則會丟失，然后使用FLAG表位捕獲整個復(fù)合物，使用RT-qPCR或新一代測序技術(shù)來鑒定miRNA和靶mRNA之間的相互作用[10]。

3 miRNA與乳腺腫瘤

miRNA表達的時序性和組織特異性提示可能靶向人類中的任何mRNA。miRNA在細胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)展過程(癌癥)中發(fā)揮巨大的作用。關(guān)于乳腺癌診斷和治療取得了進展，但仍不樂觀。Bertoli G等[3]研究表明，miRNA在乳腺癌中發(fā)揮腫瘤抑癌基因或癌基因或同時具有兩者的雙重作用，超過50%的人類miRNA基因位于腫瘤相關(guān)基因組缺失和擴增區(qū)域染色體脆性位點，提示miRNA不僅有助于乳腺腫瘤早期診斷、預(yù)后評估和療效預(yù)測，而且還起到新的治療靶點和替代療法的作用。下面討論幾種常見的miRNA 在乳腺腫瘤中作為癌基因或抑癌基因的功能。

3.1 miRNA-200家族

miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429組成?；谌旧w位置分為兩個簇，其中簇1由miR-200b、miR-200a和miR-429組成，位于人類染色體1上，由miR-200c和miR-141組成的簇2，位于人類染色體12上。兩個簇之間的基因序列僅由單個核苷酸區(qū)別，這表明miR-200的成員可能潛在地靶向相似的生理效應(yīng)基因的共同亞群，由于兩組間目標基因重疊程度相對較高，miR-200家族的所有成員適合作為靶向共同基因亞基的良好候選者。Noman M Z等[11]研究顯示miR-200家族參與癌癥干細胞(CSCs)和正常干細胞的自我更新的調(diào)控。miR-200c在胚胎癌細胞中的異位過度表達導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)分化和抑制乳腺CSCs的致瘤性。Lutful K F等[12]通過犬CMT-12、CMT-27、CMT-28對miRNA RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，miR-200a/b在3株細胞系中高度表達；而miR-200c不同的犬乳腺癌細胞系表達不同，CMT-12和CMT-27細胞系中高度上調(diào)，CMT-28細胞系表達下調(diào)。Damiano V 等[13]發(fā)現(xiàn)miR-200b / c通過抑制ZEB2表達促進間充質(zhì)細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)化(MET)，促進乳腺癌細胞系中的宏觀轉(zhuǎn)移。miR-200家族暴露于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)后下調(diào)，TGF-β可以作為誘導(dǎo)EMT表型的細胞因子，miR-200家族的重新表達顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT，而抑制miR-200家族的導(dǎo)致EMT表型的誘導(dǎo)，此外，在誘導(dǎo)EMT后，ZEB1和ZEB2的水平升高，這表明miR-200家族是間充質(zhì)標記ZEB1和ZEB2的負調(diào)節(jié)因子。因此，這些研究表明miR-200家族在乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲性的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

3.2 let-7家族

let-7家族是哺乳動物第1個被確定的miRNAs，發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲，在整個動物類群中保守，為公認的抑癌基因。let-7族由12個成員組成，包括let-7-a1、let-7-a2、let-7-a3、let-7-b、let-7-c、let-7-d、let-7-e、let-7-f1、let-7-f2、let-7-g、let-7-i和miR-98。Yu F等研究表明，let-7通常在分化程度較低的細胞中缺失，表現(xiàn)出間質(zhì)表型并代表晚期癌，相反，let-7在分化程度高的細胞中高表達，表現(xiàn)出上皮表型并代表較早期癌。進一步研究發(fā)現(xiàn)使用let-7在BT-ICs中降低其增殖能力，形成乳腺球體和腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。相反，體外敲除let-7增強非BT-IC的自我更新；過表達let-7下調(diào)致癌靶標如H-RAS和HMGA2。在富含BT-IC的細胞系中沉默H-RAS減少自我更新，但不影響分化，同時敲除HMGA2增強分化，但沒有影響自我更新，結(jié)果表明，let-7調(diào)節(jié)多種BT-IC干細胞樣特性，因此通過靶向let-7在乳腺癌患者中的癌癥治療可能是有益的，可以作為新的治療方案[14]。Dangi-Garimella S等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RKIP蛋白(Raf激酶抑制蛋白)和let-7與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，RKIP是抑制人類乳腺癌中的MAPK，G蛋白偶聯(lián)受體激酶-2和NF-κB信號級聯(lián)的抑癌基因，RKIP通過信號級聯(lián)抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，其涉及MAPK、MYC、LIN28、et-7和下游let-7靶標，如HMGA2，與癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)。雌二醇(E2)可能會增強let-7家族的8個成員的水平增加。E2也作為雌激素受體α(ER-α)和雌激素受體β(ER-β)的配體，ER-α和let-7家族的各種成員之間的表達存在逆關(guān)聯(lián)。與良性腫瘤相比，let-7家族miRNA在人乳腺癌細胞的原位導(dǎo)管癌和侵襲性導(dǎo)管癌的階段中下調(diào)，let-7家族成員在ER陽性細胞中過表達導(dǎo)致ER-α活性下調(diào)，細胞增殖減少，誘導(dǎo)細胞凋亡。關(guān)于let-7的研究結(jié)果表明它可以用作未來的癌癥治療劑。目前普遍公認的是let-7水平在正常細胞中高表達，而在侵襲性癌細胞系中表達量降低。然而，let-7異常調(diào)控機制及其在腫瘤發(fā)生中的作用尚未完全了解，進一步研究癌癥中l(wèi)et-7活性背后的分子機制將改善治療應(yīng)用的治療計劃。

3.3 miR-145

miR-145作為一種抑癌基因，在特異性階段中通過沉默不同的靶基因發(fā)揮腫瘤抑制功能。Osaki T等[16]對SNP(犬乳腺癌細胞系)和犬的正常乳腺組織miRNA 分析結(jié)果顯示，與正常相比，miR-145在SNP細胞中高表達，表達差異933.499倍，而Boggs R M等[17]研究顯示犬乳腺腫瘤中miR-145表達差異不顯著，在人乳腺癌也證明有不同的表達[3]。Ding Y等[18]通過RT-qPCR對乳腺癌和癌旁組織檢測，同時發(fā)現(xiàn)miR-145過表達降低乳腺癌細胞增殖活力及抑制TGF-G1的表達，沉默miR-145反而增強。Zhao H等[19]已經(jīng)證明，BT-IC分化所必需的胰島素受體底物-1(IRS-1)是miR-145的直接靶標，miR-145顯著性降低RTKN蛋白表達，從而抑制細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡。miR-145在乳腺癌作為抑癌基因，直接靶向FSCN-1，阻斷Oct4的表達，抑制EMT的轉(zhuǎn)移。

3.4 miR-34a

miR-34a是多種類型癌癥中表達下調(diào)的若干種miRNA之一，已被證明由p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Kato M等[20]發(fā)現(xiàn)與正常上皮細胞系和HER2+細胞系相比，三陰性和間充質(zhì)乳腺癌細胞系的miR-34a水平較低，結(jié)果表明乳腺癌亞型中的p53突變可能有助于低miR-34a表達。為了進一步闡明這些細胞中miR-34a和放射敏感性之間的關(guān)系，比較正常乳腺上皮細胞系(HMEC)，HER2+(UACC812)和間充質(zhì)細胞系(MDA-MB-231)的敏感度，發(fā)現(xiàn)與HMECs或UACC-812(具有高miR-34a水平)相比，MDA-MB-231細胞系(具有低miR-34a水平)對輻射誘導(dǎo)更敏感，增加miR-34a的水平能保護MDA-MB-231細胞免受輻射誘導(dǎo)的細胞死亡，下調(diào)miR-34a具有相反的作用，由于miR-34a水平能影響乳腺癌細胞的輻射敏感性，因此miR-34a可能具有很大的乳腺癌治療潛力。Li L等[21]研究發(fā)現(xiàn)與正常上皮細胞系184A1相比，其miR-34a表達水平在5種不同的乳腺癌細胞系中下調(diào)，miR-34a能夠通過下調(diào)Bcl-2和SIRT1抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和誘導(dǎo)細胞凋亡。Losiewicz K等[22]發(fā)現(xiàn)與正常的犬乳腺組織相比，RT-qPCR結(jié)果顯示miR-34a在乳腺癌中下降2.5倍，在肉瘤、良性腫瘤和非腫瘤病變中下降5倍，miR-34a異常表達與乳腺腫瘤的早期診斷相關(guān)。

3.5 miRNA-125

miR-125有2種已知的同種亞型，即miR-125a和miR-125b。Iorio M V等[4]和Osaki T等[16]研究發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比，在犬和人類乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)miR-125a和miR-125b均明顯下調(diào)。Guo X等[23]研究表明miRNA-125a與各種乳腺癌細胞系中的HuR表達呈負相關(guān)，過表達miR-125a導(dǎo)致HuR蛋白水平降低，抑制細胞生長，并減少細胞遷移和增殖，miR-125a可以通過利用HuR作為直接和功能靶標潛在協(xié)助抑制乳腺癌。進一步的研究表明，miR-125a和miR-125b在HER2的擴增或HER2過表達的乳腺癌中顯示下調(diào)。miR-125a和miR-125b作為抑癌基因，在SKBR3細胞(HER2過表達的人類乳腺癌細胞系)中過表達，抑制HER2 mRNA和蛋白質(zhì)水平，導(dǎo)致減少細胞生長、運動和侵襲，然而，這種影響在非轉(zhuǎn)化的HER2非依賴性乳腺癌細胞(MCF10A)中是微妙的。Sun Y 等[24]發(fā)現(xiàn)TSTA3在乳腺癌細胞和組織中高表達，與TNM分期、患者的生存期密切相關(guān)，miR-125b和miR-125a-5p在3′UTR區(qū)域共同調(diào)節(jié)TSTA3的表達，miR-125b和miR-125a-5p與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。

3.6 miRNA-10b

miR-10b作為一種抑癌基因，阻止乳腺癌的發(fā)展，以及作為一個癌基因，引起乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，Osaki T等[16]和Losiewicz K等[22]發(fā)現(xiàn)miR-10b表達在犬乳腺腫瘤中增加。Ma L等[25]miR-10b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中高度表達，在體外miR-10b被twist轉(zhuǎn)錄因子激活，引起HOXD10mRNA翻譯的中斷，這導(dǎo)致RhoC的表達增加，其促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移；與幾乎不具有轉(zhuǎn)移能力的MCF-7細胞系相比，轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231乳腺癌細胞系miR-10b表達水平明顯更高；與非轉(zhuǎn)移性對照SUM149細胞的腫瘤相比，將miR-10b轉(zhuǎn)導(dǎo)入非轉(zhuǎn)移性SUM149和SUM159原位植入小鼠乳腺，顯示miR-10b表達組表現(xiàn)出更多的癌細胞侵襲和一些呈現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移；miR-10b拮抗劑組癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移顯著抑制。Bahena O I等[26]發(fā)現(xiàn)miR-10b在乳腺癌細胞中的過表達可以抑制PTEN的表達，激活A(yù)KT信號的活性，促進細胞中EMT和干細胞標志物的表達，從而促進乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。Han X等[27]研究發(fā)現(xiàn)miR-10b表達的靶基因TGF-β1可促進TGF-β1誘導(dǎo)乳腺癌細胞EMT的發(fā)生，miR-10b表達的抑制可以部分逆轉(zhuǎn)EMT，并減弱癌細胞的增殖和侵襲能力。

3.7 miR-21

miR-21是與乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要miRNA，在包括乳腺癌在內(nèi)的各種實體腫瘤中表達上調(diào)，它在促進腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用。Iorio M V等[4]、Osaki T等[16]和Losiewicz K等[22]研究發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺腫瘤中顯著過度表達，并且與晚期階段，淋巴結(jié)陽性和存活時間減少有關(guān)；隨后的研究也證明miR-21的作用不僅在其作為生物標志物的活性中起重要作用，而且作為功能靶標。Zhao H等[19]進一步探索miR-21在乳腺癌發(fā)展和進展中的作用，用anti-miR-21寡核苷酸轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)體外細胞生長減少和在異種移植小鼠模型中體內(nèi)腫瘤生長被抑制。Chen Z等[28]和Fang H等[29]研究已經(jīng)證實miR-21影響多個靶點，包括PDCD4，TPM1，maspin和PTEN基因。然而，盡管miR-21的上調(diào)與侵襲性腫瘤相關(guān)，但仍然沒有靶標基因如PTEN和PDCD4的明確模型。miR-21是一種致癌miRNA，不僅在腫瘤生長中發(fā)揮作用，而且在靶向多種抗轉(zhuǎn)移基因的侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用，進一步的研究應(yīng)該探討miR-21靶標，以利于更好的乳腺癌的靶向治療。

3.8 miRNA-155

miR-155是表現(xiàn)出癌基因性質(zhì)的miRNA，在乳腺癌細胞中的表達明顯增加。Kong W等報道m(xù)iR-155通過RhoA基因可以激活TGF-β/ Smad4信號，從而促進EMT。相反，miR-155的敲除可以顯著抑制TGF-β/ Smad4誘導(dǎo)的EMT。在乳腺癌細胞系中SOCS1已被確定為miR-155的靶標，SOCS1的表達與miR-155的表達呈負相關(guān)。miR-155過表達增強乳腺癌細胞的增殖和體內(nèi)腫瘤的發(fā)展。此外，在乳腺癌細胞中沉默SOCS1重新建立了miR-155的致癌作用，而恢復(fù)SOCS1表達促進了miR-155的促腫瘤生長功能，表明miR-155負調(diào)節(jié)SOCS1[30]。Kong W等[31]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中miR-155負調(diào)控靶向FOXO3a，miR-155過表達導(dǎo)致抑制FOXO3a表達以誘導(dǎo)EMT，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號，并下調(diào)RhoA表達，從而誘導(dǎo)細胞存活和增強癌細胞的耐藥性，并且miR-155的敲除，導(dǎo)致FOXO3a增加，誘導(dǎo)細胞凋亡和化學(xué)敏感性的增加，這項研究表明，乳腺癌細胞系miR-155與FOXO3a之間存在逆向相關(guān)性，提示miR-155是乳腺癌中必不可少的治療靶點。

3.9 miRNA-221和miRNA-222

miR-221和miR-222都被鑒定為基底樣乳腺癌亞型特異性miRNA，兩種miRNA作為EMT的調(diào)節(jié)因子，引起細胞遷移和侵襲增加。Hwang M S 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221和miR-222抑制靶標TRPS1表達，相反增加ZEB2表達。Alamolhodaei N S等[33]進一步的研究顯示，miR-221和miR-222差異表達，兩種miRNA在雌激素受體陰性(ER-)乳腺癌中過表達，而這些miRNA在乳腺癌中的過表達有助于侵襲性的基底樣乳腺癌的進展，抑制細胞周期抑制蛋白p27/Kip1和p57，導(dǎo)致細胞增殖增加，這些特征也有助于他莫昔芬在基底型乳腺癌中的耐藥；將miR-221和miR-222合成模擬物轉(zhuǎn)染到非轉(zhuǎn)化乳腺細胞系MCF10A中導(dǎo)致誘導(dǎo)的EMT樣表型，增加侵襲和遷移，并增加間充質(zhì)標志物vimentin表達。此外，抑制轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231乳腺癌細胞系中的miR-221和miR-222出現(xiàn)反向表型，因此，兩種miRNA在促進臨床侵襲性基底樣乳腺癌中起著重要作用。

3.10 其他miRNA

Hannafon B N等[34]發(fā)現(xiàn)致癌基因miR-182和miR-183在導(dǎo)管原位癌(DCIS)中過表達，抑制miR-182和miR-183導(dǎo)致其4種靶基因(CBX7、DOK4、NMT2和EGR1)的上調(diào)，同時又導(dǎo)致E鈣黏蛋白表達的上調(diào)，這表明敲除這2種miRNA可能對乳腺癌恢復(fù)正常的上皮細胞形態(tài)具有重要的意義。Rybicka A 等[35]發(fā)現(xiàn)miR-214在犬乳腺細胞系(CMT-12、CMT-27、CMT-128)中下調(diào)但是與正常乳腺組織相比，miRNA基因芯片分析顯示miRNA-183在犬乳腺腫瘤SNP細胞低表達，下降比率為0.190 3。Wang F等[36]研究發(fā)現(xiàn)與其在非惡性乳腺上皮細胞系MCF-10A中的表達水平相比，在4種人乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、 MDA-MB-453 和T47D)miR-214的表達上調(diào)。此外，miR-214的過表達顯著增加了細胞活力，并消除了血清饑餓引發(fā)的凋亡，表明miR-214在乳腺癌細胞生長中起關(guān)鍵作用。此外，通過生物信息學(xué)分析和雙螢火蟲熒光素酶報告基因測定，PTEN被證實作為miR-214的直接靶標；重要的是，缺乏3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的PTEN cDNA的引入顯著抑制miR-214誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路的激活，并且消除了miR-214對細胞存活和抗凋亡的保護作用，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-214具有致癌活性，其作用是通過靶向PTEN-PI3K/Akt途徑促進細胞生長而介導(dǎo)的。因此，針對miR-124的藥物干預(yù)可為乳腺癌的治療提供有希望的治療策略。

4 miRNA在腫瘤診斷中的研究前景

腫瘤標志物在乳腺腫瘤早期診斷、預(yù)防、藥效評價及預(yù)后評價等方面發(fā)揮著極其重要的作用。但miRNA在犬乳腺腫瘤的早期診斷研究還處于起步階段，同時在人類乳腺癌中還有很多復(fù)雜的機制尚未完全清楚。隨著miRNA作用機制及與腫瘤之間關(guān)系的進一步深入研究，對腫瘤特異的miRNA表達譜的分析、確立，以及miRNA臨床檢測方法的不斷完善，以實現(xiàn)miRNA對人類及犬乳腺腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估，從而為人類和犬乳腺腫瘤帶來新的預(yù)防、診斷和治療手段。

參考文獻:

[1] Torre L A,Bray F,Siegel R L,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin，2015,65(2):87-108.

[2] Rivera P,von Euler H.Molecular biological aspects on canine and human mammary tumors[J].Vet Pathol,2011,48(1):132-146.

[3] Bertoli G,Cava C,Castiglioni I.The potential of miRNAs for diagnosis,treatment and monitoring of breast cancer[J].Scand J Clin Lab Invest Suppl,2016,245:S34-S39.

[4] Iorio M V,Croce C M.MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics,monitoring and therapeutics.A comprehensive review[J].EMBO Mol Med,2012,4(3):143-159.

[5] Czech B,Hannon G J.Small RNA sorting:matchmaking for Argonautes[J].Nat Rev Genet,2011,12(1):19-31.

[6] Liu M,Roth A,Yu M,et al.The IGF2 intronic miR-483 selectively enhances transcription from IGF2 fetal promoters and enhances tumorigenesis[J].Genes Dev,2013,27(23):2543-2548.

[7] Shen Y,Tian F,Chen Z,et al.Amplification-based method for microRNA detection[J].Biosens Bioelectron,2015,71:322-331.

[8] Nuttle X,Itsara A,Shendure J,et al.Resolving genomic disorder-associated breakpoints within segmental DNA duplications using massively parallel sequencing[J].Nat Protoc,2014,9(6):1496-1513.

[9] Muniategui A,Pey J,Planes F J,et al.Joint analysis of miRNA and mRNA expression data[J].Brief Bioinform,2013,14(3):263-278.

[10] Cambronne X A,Shen R,Auer P L,et al.Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(50):20473-20478.

[11] Noman M Z,Janji B,Abdou A,et al.The immune checkpoint ligand PD-L1 is upregulated in EMT-activated human breast cancer cells by a mechanism involving ZEB-1 and miR-200[J].Oncoimmunology,2017,6(1):e1263412.

[12] Lutful K F,Deinnocentes P,Bird R C.Altered microRNA expression profiles and regulation of INK4A/CDKN2A tumor suppressor genes in canine breast cancer models[J].J Cell Biochem,2015,116(12):2956-2969.

[13] Damiano V,Brisotto G,Borgna S,et al.Epigenetic silencing of miR-200c in breast cancer is associated with aggressiveness and is modulated by ZEB1[J].Genes Chromosomes Cancer,2017,56(2):147-158.

[14] Sun X,Liu J,Xu C,et al.The insights of Let-7 miRNAs in oncogenesis and stem cell potency[J].J Cell Mol Med,2016,20(9):1779-1788.

[15] Dangi-Garimella S,Yun J,Eves E M,et al.Raf kinase inhibitory protein suppresses a metastasis signalling cascade involving LIN28 and let-7[J].EMBO J,2009,28(4):347-358.

[16] Osaki T,Sunden Y,Sugiyama A,et al.Establishment of a canine mammary gland tumor cell line and characterization of its miRNA expression[J].J Vet Sci,2016,17(3):385.

[17] Boggs R M,Wright Z M,Stickney M J,et al.MicroRNA expression in canine mammary cancer[J].Mammalian Genome,2008,19(7-8):561-569.

[18] Ding Y,Zhang C,Zhang J,et al.miR-145 inhibits proliferation and migration of breast cancer cells by directly or indirectly regulating TGF-beta1 expression[J].Int J Oncol,2017,50(5):1701-1710.

[19] Zhao H,Kang X,Xia X,et al.miR-145 suppresses breast cancer cell migration by targeting FSCN-1 and inhibiting epithelial-mesenchymal transition[J].Am J Transl Res,2016,8(7):3106-3114.

[20] Kato M,Paranjape T,Muller R U,et al.The mir-34 microRNA is required for the DNA damage responseinvivoin C.elegans andinvitroin human breast cancer cells[J].Oncogene,2009,28(25):2419-2424.

[21] Li L,Yuan L,Luo J,et al.MiR-34a inhibits proliferation and migration of breast cancer through down-regulation of Bcl-2 and SIRT1[J].Clin Exp Med,2013,13(2):109-117.

[22] Losiewicz K,Chmielewska-Krzesinska M,Socha P,et al.MiRNA-21,miRNA-10b,and miRNA-34a expression in canine mammary gland neoplasms[J].Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy,2014,58(3):447-451.

[23] Guo X,Wu Y,Hartley R S.MicroRNA-125a represses cell growth by targeting HuR in breast cancer[J].RNA Biol,2009,6(5):575-583.

[24] Sun Y,Liu X,Zhang Q,et al.Oncogenic potential of TSTA3 in breast cancer and its regulation by the tumor suppressors miR-125a-5p and miR-125b[J].Tumor Biol,2016,37(4):4963-4972.

[25] Ma L,Teruya-Feldstein J,Weinberg R A.Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J].Nature,2007,449(7163):682-688.

[26] Bahena-Ocampo I,Espinosa M,Ceballos-Cancino G,et al.miR-10b expression in breast cancer stem cells supports self-renewal through negative PTEN regulation and sustained AKT activation[J].EMBO Rep,2016,17(7):1081.

[27] Han X,Yan S,Weijie Z,et al.Critical role of miR-10b in transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer[J].Cancer Gene Ther,2014,21(2):60-67.

[28] Chen Z,Yuan Y C,Wang Y,et al.Down-regulation of programmed cell death 4 (PDCD4) is associated with aromatase inhibitor resistance and a poor prognosis in estrogen receptor-positive breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2015,152(1):29-39.

[29] Fang H,Xie J,Zhang M,et al.miRNA-21 promotes proliferation and invasion of triple-negative breast cancer cells through targeting PTEN[J].Am J Transl Res,2017,9(3):953-961.

[30] Kong W,Yang H,He L,et al.MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity by targeting RhoA[J].Mol Cell Biol,2008,28(22):6773-6784.

[31] Kong W,He L,Coppola M,et al.MicroRNA-155 regulates cell survival,growth,and chemosensitivity by targeting FOXO3a in breast cancer[J].J Biol Chem,2016,291(43):22855.

[32] Hwang M S,Yu N,Stinson S Y,et al.miR-221/222 targets adiponectin receptor 1 to promote the epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer[J].PLoS One,2013,8(6):e66502.

[33] Alamolhodaei N S,Behravan J,Mosaffa F,et al.MiR 221/222 as new players in tamoxifen resistance[J].Curr Pharm Des,2016,22(46):6946-6955.

[34] Hannafon B N,Sebastiani P,de Las M A,et al.Expression of microRNA and their gene targets are dysregulated in preinvasive breast cancer[J].Breast Cancer Res,2011,13(2):R24.

[35] Rybicka A,Mucha J,Majchrzak K,et al.Analysis of microRNA expression in canine mammary cancer stem-like cells indicates epigenetic regulation of transforming growth factor-beta signaling[J].J Physiol Pharmacol,2015,66(1):29-37.

[36] Wang F,Li L,Chen Z,et al.MicroRNA-214 acts as a potential oncogene in breast cancer by targeting the PTEN-PI3K/Akt signaling pathway[J].Int J Mol Med,2016,37(5):1421-1428.