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(1.達(dá)能(中國(guó))食品飲料有限公司,廣東中山 528415; 2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510000)

隨著科技的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高,食品安全日益受到人們的關(guān)注,其中微生物污染是影響食品安全的主要因素,因此作為食品生產(chǎn)企業(yè),對(duì)微生物污染的預(yù)防和監(jiān)控顯得尤為重要。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、不易檢出芽孢等缺點(diǎn)[1],嚴(yán)重影響了對(duì)微生物污染控制的時(shí)效性,從而制約了企業(yè)的放貨速度和運(yùn)轉(zhuǎn)效率,這是所有食品行業(yè)所面臨的共同難題。近年來,隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,各種快速檢測(cè)方法如生物熒光法、免疫化學(xué)法和流式細(xì)胞技術(shù)等已廣泛運(yùn)用于食品、飲料、發(fā)酵和環(huán)保領(lǐng)域,其中流式細(xì)胞技術(shù)(Flow Cytometry,FCM)因其可解決傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段檢測(cè)周期過長(zhǎng)、無法大批量檢測(cè)樣本等缺點(diǎn)[1]而廣受青睞。FCM法是一種采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)溶液中懸浮細(xì)胞或微粒的現(xiàn)代分析技術(shù),通過熒光探針的協(xié)助,從分子水平上獲取多種信號(hào),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選,有研究報(bào)道[2-4]比較了流式細(xì)胞法與平板法或?yàn)V膜法檢測(cè)菌落總數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)間只需2 h左右,而平板計(jì)數(shù)法或?yàn)V膜法則需要2 d左右,而且在一定濃度范圍內(nèi),前者具有更好的符合性,更加靈敏、準(zhǔn)確、高通量,對(duì)液態(tài)食品的貨架期、倉(cāng)儲(chǔ)、保質(zhì)期、出口等順利進(jìn)行提供了高效的技術(shù)平臺(tái)[1,5]。

FCM法在細(xì)菌[6-7]、真菌等微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用已非常廣泛[8-9],目前已成為飲料、發(fā)酵和環(huán)保等微生物質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域的常用工具和有力手段[10-12],但是關(guān)于FCM法直接檢測(cè)低含菌量的酸性飲料菌落總數(shù)方面的應(yīng)用研究,國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道。2015年國(guó)家食品安全法提倡食品飲料企業(yè)運(yùn)用先進(jìn)的技術(shù)手段來加速產(chǎn)品放行,因此將流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用到含菌量低的酸性飲料菌落總數(shù)的檢測(cè),對(duì)于飲料行業(yè)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義,可以縮短培養(yǎng)時(shí)間,加快產(chǎn)品放行,從而提高產(chǎn)品的新鮮度,降低庫(kù)存成本。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

酸性飲料(pH<4.6)中山市小欖鎮(zhèn)超市購(gòu)買;胰蛋白胨大豆瓊脂TSA、平板計(jì)數(shù)瓊脂PCA、營(yíng)養(yǎng)肉湯TSB、無菌平皿(50 mm & 90 mm)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;0.85%無菌生理鹽水自制;0.45 μm濾膜密理博(中國(guó))有限公司;CS13、ChemSol S 50X、Diluent R、CSR、Isored、Antifoam、Cleaning 5、Cleaning 3、Standard G、ChemChrome V26、CSV、B24梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；實(shí)驗(yàn)用菌株詳見表1所示。

BactiFlow ALS system流式細(xì)胞儀梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;生物安全柜/超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;生化培養(yǎng)箱美墨爾特(上海)貿(mào)易有限公司;三聯(lián)過濾裝置密理博(中國(guó))有限公司。

表1　實(shí)驗(yàn)用菌株編號(hào)及名稱Table 1　Number and name of the test strains

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的保藏和活化實(shí)驗(yàn)菌株在TSA培養(yǎng)基上,(36±1) ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行復(fù)蘇,對(duì)復(fù)蘇后的菌株純度及生化特性做確認(rèn),通過一系列的生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA測(cè)序及MODI-TOF分子生物學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)確證實(shí)驗(yàn)菌株。將表1所列菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯TSB培養(yǎng)基中,(36±1) ℃培養(yǎng)24 h 后,菌懸液備用。

1.2.2濾膜法將含菌飲料手動(dòng)混勻,在無菌操作環(huán)境下,抽濾250 mL含菌飲料,用無菌鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA),于(36±1) ℃倒置培養(yǎng)(48±4) h,觀察并計(jì)數(shù)[13]。

1.2.3FCM法增菌:將含菌飲料手動(dòng)搖勻,在無菌操作環(huán)境下,抽濾250 mL含菌飲料,用無菌鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至100 mL TSB肉湯,于(36±1) ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)。

檢測(cè):用無菌移液器移取上述增菌后的菌液100 μL加入20 mL無菌試管中,依次加入90 μL CS13,于無菌環(huán)境靜置30～60 min。開機(jī)清洗校正完成后將含樣品的20 mL試管置于SPU樣品架,試劑Cleaning 5、還原劑(CSR+DR+隔離油)、CSV和B24放置在試劑架,V26放置在冷卻架。編輯程序,運(yùn)行檢測(cè),其稀釋倍數(shù)為30[14]。

1.2.4平板法將菌液手動(dòng)搖勻,在無菌操作環(huán)境下,用無菌移液器移取1 mL含菌溶液至無菌平皿中,傾注溫度為(46±1) ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA),搖勻,靜置凝固后倒置于(36±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(48±4) h,觀察并計(jì)數(shù)[15]。

1.2.5FCM法和平板法檢測(cè)不同基質(zhì)中實(shí)驗(yàn)菌株菌濃度的對(duì)比研究以生理鹽水為基質(zhì),將表1中的新鮮培養(yǎng)物制備成約103～109CFU/mL濃度的菌懸液,分別運(yùn)用平板法和FCM法對(duì)菌懸液的菌濃度進(jìn)行檢測(cè)。

以酸性飲料為基質(zhì),將表1中的新鮮培養(yǎng)物制備成約103～109CFU/mL濃度的菌懸液,分別運(yùn)用平板法和FCM法對(duì)菌懸液的菌濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6增菌時(shí)間對(duì)FCM法和平板法檢測(cè)低含菌量樣品菌濃度的影響以酸性飲料為基質(zhì),選擇常見實(shí)驗(yàn)菌株13株(A～M),制備濃度為1～10 CFU/250 mL的菌懸液,菌懸液的初始菌濃度由濾膜法確定。另過濾富集250 mL樣品中的微生物,將濾膜置于100 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中,(36±1) ℃增菌培養(yǎng)6 h和22 h后,使用FCM法與平板法同時(shí)檢測(cè)增菌后的微生物水平,對(duì)FCM法與平板法的檢測(cè)結(jié)果與濾膜法的定性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2.7增菌時(shí)間對(duì)FCM法檢測(cè)強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌菌濃度的影響以酸性飲料為基質(zhì),選擇生長(zhǎng)較為緩慢的強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌(A和B),分別制備成濃度為1～10 CFU/250 mL的菌懸液。每個(gè)菌株選擇6個(gè)樣品(A-1～A-6,B-1～B-6),樣品的菌濃度由濾膜法確定均在1～10 CFU/250 mL的范圍內(nèi),分別過濾富集250 mL樣品中的微生物,將濾膜置于100 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中(36±1) ℃培養(yǎng)0、6、22 h后,采用FCM法檢測(cè)增菌后的微生物水平,每個(gè)樣品分別上機(jī)檢測(cè)2次,并與濾膜法的定性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,分析增菌時(shí)間對(duì)FCM法檢測(cè)強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌的影響。

1.2.8濾膜法與增菌22 h后FCM法定性結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以酸性飲料為基質(zhì),選擇常見實(shí)驗(yàn)菌株13株(A～M),分別制備成濃度為1～10 CFU/250 mL,10～100 CFU/250 mL和>100 CFU/250 mL的菌懸液。120個(gè)陰性樣品(無菌酸性飲料)與936個(gè)陽(yáng)性樣品(每個(gè)菌株每個(gè)濃度梯度選擇24個(gè)樣品),分別過濾富集250 mL樣品中的微生物,將濾膜置于100 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中(36±1) ℃增菌培養(yǎng)22 h,采用FCM法檢測(cè)增菌后的微生物水平,每個(gè)樣品分別上機(jī)檢測(cè)2次,并與濾膜法的定性檢測(cè)結(jié)果對(duì)比,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3　數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用McNemar的Kappa統(tǒng)計(jì)分析1.2.8的檢測(cè)結(jié)果[16]。

2　結(jié)果與分析

2.1　蠟樣芽孢桿菌在不同基質(zhì)中FCM法和平板法檢測(cè)結(jié)果的一致性研究

圖1　FCM法和平板法檢測(cè)不同基質(zhì)中蠟樣芽孢桿菌結(jié)果的線性關(guān)系Fig.1　The linearity of FCM and pour plate methods to test bacillus cereus in different substrates

FCM法與平板法檢測(cè)不同基質(zhì)中蠟樣芽孢桿菌(G)結(jié)果的線性關(guān)系如圖1所示。以生理鹽水為基質(zhì),蠟樣芽孢桿菌有1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL七個(gè)濃度梯度,平板法和FCM法檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系為R2=0.9823>0.95;以酸性飲料基質(zhì),蠟樣芽孢桿菌有1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL五個(gè)濃度梯度,平板法和FCM法檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系為R2=0.9607>0.95。說明在酸性飲料和生理鹽水中兩種方法對(duì)于蠟樣芽孢桿菌菌濃度的檢測(cè)在一定濃度范圍內(nèi)均具有較高的相關(guān)性,無顯著性差異,采用FCM法可以準(zhǔn)確的檢出蠟樣芽孢桿菌。

2.2　不同基質(zhì)對(duì)FCM法與平板法檢測(cè)13種實(shí)驗(yàn)菌株菌濃度的影響

不同濃度13種(A～M)實(shí)驗(yàn)菌株在酸性飲料中和生理鹽水中FCM法和平板法的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。以生理鹽水為基質(zhì)時(shí),FCM法和平板法的計(jì)數(shù)結(jié)果表現(xiàn)出較高的一致性,除菌株E和G外平板法與FCM法檢測(cè)結(jié)果均在一個(gè)數(shù)量級(jí)上。以酸性飲料為基質(zhì)時(shí),其中C、D、E、F、H、I、L、M均不能被FCM法檢出,另A、B、G、J、K可以被平板法和FCM法檢出,但差異較大。一方面可能是由于酸性飲料基質(zhì)成分會(huì)特異性的干擾部分菌株;另一方面可能是FCM的檢測(cè)限一般在102～103CFU/mL,對(duì)于低含菌量的樣品無法檢測(cè)出其初始菌濃度[17-18]。故針對(duì)含菌量低的酸性飲料可過濾富集后增菌培養(yǎng),一方面排除基質(zhì)的干擾[4],另一方面通過增菌培養(yǎng)達(dá)到FCM法的最低檢測(cè)限,以獲得與濾膜法或平板法更為一致的定性結(jié)果。

表2　FCM法與平板法檢測(cè)不同基質(zhì)中13種實(shí)驗(yàn)菌株的菌濃度結(jié)果對(duì)比Table 2　The results comparison of FCM and pour plate methods to detect 13 strains in different substrates

2.3　增菌時(shí)間對(duì)FCM法和平板法檢測(cè)低含菌量樣品菌濃度的影響

表3　酸性飲料中13種實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)增菌6 h和22 h后FCM法和平板法的檢測(cè)結(jié)果Table 3　The results of FCM and pour plate methods to detect 13 strains in acid beverage after proliferation for 6 h and 22 h

增菌時(shí)間對(duì)FCM法和平板法檢測(cè)低含菌量樣品菌濃度的影響如表3所示。初始菌液經(jīng)濾膜法計(jì)數(shù)均為陽(yáng)性,增菌6 h后,強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌(A和B)可以被平板法檢出而不能被FCM法檢出,可能是由于強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌生長(zhǎng)分裂緩慢,故在培養(yǎng)6 h后含菌量還不足以達(dá)到FCM法的最低檢測(cè)限;當(dāng)增菌時(shí)間延長(zhǎng)至22 h,13種實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)FCM法檢測(cè)均能獲得與濾膜法一致的定性結(jié)果,且FCM法的定量檢測(cè)結(jié)果與平板法均在一個(gè)數(shù)量級(jí),說明增菌22 h,可以獲得更為穩(wěn)定的結(jié)果。

2.4　增菌時(shí)間對(duì)FCM法檢測(cè)強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌菌濃度的影響

酸性飲料中不同濃度強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌(A和B),經(jīng)增菌0、6、22 h后,FCM法的檢測(cè)結(jié)果如表4所示。0 h時(shí),FCM法檢測(cè)結(jié)果為陰性,顯示未檢出;增菌時(shí)間延長(zhǎng)至6 h,部分FCM法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,與濾膜法的定性結(jié)果是一致的,但仍有部分FCM法檢測(cè)結(jié)果顯示陰性,說明部分菌株生長(zhǎng)稍緩慢,在增菌6 h的情況下,菌株還未能繁殖至FCM法的最低檢測(cè)限,從而無法與濾膜法獲得一致的定性結(jié)果。當(dāng)增菌時(shí)間延長(zhǎng)至22 h,所有樣品的FCM法檢測(cè)結(jié)果均顯示陽(yáng)性與濾膜法的定性結(jié)果一致,說明增菌時(shí)間達(dá)到22 h時(shí),FCM法可替代濾膜法進(jìn)行酸性飲料中強(qiáng)壯類和愛媛類芽孢桿菌的定性檢測(cè)。

2.5　濾膜法與增菌22 h后FCM法定性結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)酸性飲料中低、中和高濃度的13種(A～M)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行濾膜法與FCM法檢測(cè)結(jié)果的定性對(duì)比研究。在增菌22 h的條件下,對(duì)于低、中和高濃度的13種實(shí)驗(yàn)菌株FCM法與濾膜法表現(xiàn)出高度一致的定性結(jié)果,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表5所示。在初始含菌量<1 CFU/250 mL的情況下,卡方值X2=1.5<3.84，F(xiàn)CM法的假陽(yáng)性率=4.2%<9.6%，特異性=95.8%>90.4%;當(dāng)初始含菌量在1～10 CFU/250 mL的范圍內(nèi)時(shí),卡方值X2=1.1<3.84,FCM法的假陰性率=1.9%<2%,靈敏度=98.1%>98%;當(dāng)初始含菌量>10 CFU/250 mL時(shí),靈敏度=100%>98%,無假陰性的結(jié)果。以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[16]表明濾膜法與增菌22 h后FCM法的定性結(jié)果無顯著差異；在增菌22 h的條件下,FCM法可替代濾膜法進(jìn)行酸性飲料中菌落總數(shù)的定性檢測(cè),從而縮短檢測(cè)周期,加速產(chǎn)品放行。

注：a:每250 mL酸性飲料中含有的細(xì)菌總數(shù)的可能數(shù);b:反應(yīng)FCM法和達(dá)能濾膜法確認(rèn)性結(jié)果相等的數(shù)量;c:樣品的數(shù)量;d:x2由NcNema定義為(|m-n|-1)2/(m+n)，其中m等于FCM法的陽(yáng)性樣本數(shù)和達(dá)能濾膜法的陰性樣本數(shù)，n等于FCM法的陰性性樣本數(shù)和達(dá)能濾膜法的陽(yáng)性樣本數(shù)。x2值大于3.84表示顯著性差異為p<0.05。e:假陰性率為100-靈敏度;f:靈敏度定義為100乘以“已知”陽(yáng)性測(cè)試樣品數(shù)除以“已知”樣品總數(shù)，“已知”指用參考方法確認(rèn);g:假陽(yáng)性率為100-特異性;h:特異性定義為100乘以“已知”陰性測(cè)試樣品數(shù)除以“已知”樣品總數(shù)，“已知”指用參考方法確認(rèn)。

3　結(jié)論

本研究采用FCM法替代濾膜法定性檢測(cè)低含菌量酸性飲料的菌落總數(shù),通過添加不同類型的13種(A～M)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證。模擬酸性飲料在不同濃度不同種類微生物污染的情況下,過濾富集菌于TSB肉湯中增菌培養(yǎng)一定時(shí)間,經(jīng)FCM法檢測(cè),并與平板法和濾膜法進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明:FCM法可替代濾膜法用于酸性飲料菌落總數(shù)的定性檢測(cè)從而加速產(chǎn)品放行。FCM法可短時(shí)間內(nèi)出具產(chǎn)品的微生物分析結(jié)果,能夠?qū)ιa(chǎn)、運(yùn)輸和庫(kù)存環(huán)節(jié)的微生物污染進(jìn)行及時(shí)有效的控制而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益[19],比濾膜法或平板法節(jié)省1 d的檢測(cè)時(shí)間。FCM法檢測(cè)成本高,因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)試劑和耗材的研究和開發(fā),降低檢測(cè)成本,從而使FCM法檢測(cè)菌落總數(shù)可以得到更為廣泛的運(yùn)用;其次進(jìn)一步縮短培養(yǎng)時(shí)間或運(yùn)用FCM法對(duì)低含菌量酸性飲料中霉菌、酵母以及耐酸菌的檢測(cè)在食品飲料企業(yè)亦具有非常廣大的應(yīng)用前景。

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