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(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076)

紅松(PinuskoraiensisSieb.etZucc.)主要分布于俄羅斯遠(yuǎn)東南部、朝鮮半島、日本本州及中國東北部地區(qū),分布數(shù)量以中國為首,主要集中于長白山,小興安嶺一帶,屬于天然可再生資源[1]。松針是松樹的針形葉子,松屬植物的副產(chǎn)物之一,含有豐富的黃酮、揮發(fā)油、色素、維生素、粗蛋白、萜類等多種成分。具有止咳鎮(zhèn)痛,疏風(fēng)活血,明目安神,提高免疫力,降三高等作用[2-3]。關(guān)于松針國內(nèi)外研究,主要對松針化學(xué)成分進行分析[4],其黃酮物質(zhì)具有抗氧化和抗腫瘤作用[5],松針提取物可以減輕大鼠胰島素抵抗力[6]。提取物中精油可以提高小鼠記憶力,且具有抑菌作用[7-8]。針葉被廣泛運用在茶飲及乳制品等的制作中[9-10]。高巖等[12]采用乙醇溶液回流法從紅松針中提取黃酮類物質(zhì);站英等[13]采用微波輔助乙醇法確定了紅松針總黃酮提取的最佳工藝;文攀等[14]利用超聲波輔助提取紅松籽殼中的總黃酮。以往研究中對東北紅松針黃酮研究較少,本實驗主要針對東北豐富的紅松資源并結(jié)合超聲波空穴作用,以優(yōu)化超聲波輔助乙醇提取總黃酮工藝條件為目的,探索東北紅松針總黃酮的含量,為大批量合理開發(fā)利用東北松針資源提供可行性理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紅松松針新鮮松針預(yù)處理除雜,室溫下陰干,粉碎后過60目篩儲存在廣口瓶中備用,黑龍江省小興安嶺;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)中國食品藥品鑒定研究院;無水乙醇(分析純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)、氫氧化鈉(分析純)天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DEF-500型搖擺式高速萬能粉碎機溫嶺市林大機械有限公司;HC-7P11-5 型架盤藥物天平上海精科科技有限公司;FA2004B型電子天平上海越平科學(xué)儀器有限公司;KQ-500VDED雙頻數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;TDL-4A 離心機上海菲恰爾分析儀器有限公司;V5000型可見分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1工藝流程新鮮紅松松針除雜陰干→粉碎過篩(60目篩)→稱取松針粉末→乙醇溶解→超聲輔助提取→離心(4000 r/min)→上清液定容→NaNO2-Al(NO3)3顯色法顯色(參照文獻(xiàn)[15])→測定吸光度→計算總黃酮得率。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,硝酸鋁顯色法[16]制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,分析處理可得到線性回歸方程。

1.2.3總黃酮得率的計算取在不同條件下所得的樣品濾液稀釋到一定體積,并取稀釋液1.0 mL于10 mL比色管中,顯色反應(yīng)后,測定其吸光度,結(jié)合公式(1)和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,求出松針總黃酮的得率[17]。

式(1)

式中:Y-松針總黃酮得率,%;C-松針總黃銅質(zhì)量濃度,mg/mL;N-稀釋的倍數(shù);m-稱取松針粉末的質(zhì)量,g;V-提取液體積,mL。

1.2.4單因素實驗實驗以松針總黃銅得率為評價指標(biāo),選取工藝中的料液比、超聲時間、超聲溫度和乙醇的體積分?jǐn)?shù)為影響因素確定其提取的最適范圍,平行實驗三次,計算得率。單因素實驗設(shè)計如下:

1.2.4.1不同料液比對松針總黃酮得率的影響準(zhǔn)確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,設(shè)置料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL,乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%,超聲溫度為65 ℃,功率為500 W的條件下,超聲100 min后4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.4.2不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對松針總黃酮得率的影響準(zhǔn)確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比為1∶50 g/mL,超聲溫度為65 ℃,功率為500 W的條件下超聲100 min后4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.4.3不同超聲溫度對松針總黃酮得率的影響準(zhǔn)確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,設(shè)置超聲溫度為40、50、60、70、80、90 ℃下,料液比為1∶50 g/mL,功率為500 W的條件下,超聲100 min后,同樣4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.4.4不同超聲時間對松針總黃酮得率的影響準(zhǔn)確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液,料液比為1∶50 g/mL,超聲溫度為65 ℃,500 W下分別超聲20、40、60、80、100、120、140、160、180 min后,4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.5Box-Behnken響應(yīng)面實驗優(yōu)化提取條件在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計原理[18],選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時間為影響因素[19]。設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實驗,進一步優(yōu)化分析,確定超聲波輔助乙醇提取紅松松針總黃酮的最佳條件[20]。設(shè)計因素水平表見表1。

表1　響應(yīng)曲面因素水平表Table 1　Analytical factors and levels of response surface methodology

1.3　數(shù)據(jù)處理

實驗操作重復(fù)三次取平均值,計算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖分析。根據(jù)Design-Expert 8.05軟件,設(shè)計響應(yīng)面實驗方案、建立數(shù)學(xué)模型并進行多元回歸分析,選擇最佳提取工藝參數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

可見分光光度計510 nm處測定不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]。如圖1所示,可以得到方程y=11.75x+0.0006,R2=0.9971。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of rutin

2.2　單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1料液比對紅松松針總黃酮得率的影響根據(jù)圖2可知,當(dāng)料液比在1∶10～1∶50 g/mL之間,增大料液比,總黃酮得率隨之升高。當(dāng)料液比為1∶50 g/mL時,得率最高,而當(dāng)料液比超過1∶50 g/mL時,得率開始下降,黃酮的溶解已達(dá)到了飽和,其他非黃酮類成分隨著溶出,影響總黃酮得率。根據(jù)總黃酮得率,可以確定料液比為1∶50 g/mL時為最適料液比。

圖2　料液比對松針中總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of ratio of material to liquid on the yield of total flavonoid from pine needle

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅松松針總黃酮得率的影響根據(jù)圖3可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,總黃酮得率也隨之升高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時總黃酮得率最高,乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%之后,得率卻隨之下降。乙醇濃度的大小影響著極性的大小,當(dāng)濃度為50%時,與松針總黃酮的極性相似,溶解率達(dá)到了最大,而乙醇的體積濃度過大時,醇溶性雜質(zhì)也會隨著溶出,影響總黃酮得率[22]。因此確定最適乙醇體積濃度為50%。

圖3　乙醇的體積分?jǐn)?shù)對松針中總黃酮得率的影響Fig.3　Effects of ethanol concentration on the yield of total flavonoid from pine needle

2.2.3超聲溫度對紅松松針總黃酮得率的影響根據(jù)圖4可知,當(dāng)溫度在40～70 ℃之間,溫度升高,總黃酮得率也隨之升高,在一定溫度下,物質(zhì)的溶解量是一定的,溫度升高,加快了分子的運動速度,總黃酮溶解滲透能力升高,當(dāng)溫度大于70 ℃,總黃酮得率下降,過高的溫度導(dǎo)致部分黃酮內(nèi)部結(jié)構(gòu)破損,失去活性,得率降低[23],因此超聲最適溫度為70 ℃。

圖4　超聲溫度對松針中總黃酮得率的影響Fig.4　Effects of ultrasonic temperature on the yield of flavonoid from pine needle

2.2.4超聲時間對紅松松針總黃酮得率的影響由圖5可知,當(dāng)超聲時間從20 min增長到100 min時,隨著時間的增加,總黃酮得率也隨之升高,開始提取時,總黃酮物質(zhì)與乙醇溶液之間存在濃度差,增長提取時間,黃酮類物質(zhì)充分溶出,濃度差減小,當(dāng)超聲時間為100 min時,總黃酮溶解度飽和,得率達(dá)到了最高。之后隨時間增加,提取率反而下降,可能的原因是超聲波的空穴作用過度,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損,胞內(nèi)非黃酮物質(zhì)隨之溶出,使得率下降[24],因此確定提取的最佳時間為100 min。

圖5　超聲時間對松針中總黃酮得率的影響Fig.5　Effects of ultrasonic time on the yield of total flavonoid from pine needle

2.3　響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.3.1模型組合設(shè)計及方差分析應(yīng)用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理,選擇A料液比、B乙醇體積分?jǐn)?shù)、C超聲溫度、D超聲時間為影響主要因素,以東北紅松松針Y總黃酮得率為響應(yīng)值[25],得出的實驗結(jié)果見表2,超聲波輔助乙醇提取東北紅松松針總黃酮得率數(shù)據(jù)模型方差分析表見表3。

表2　響應(yīng)面分析設(shè)計及結(jié)果Table 2　Design and results of response surface analysis

表3　響應(yīng)曲面方差分析表Table 3　Analysis of response surface variance table

注：*：p<0.05表示差異顯著;**：p<0.01表示差異較顯著;***：p<0.001表示差異極顯著。

利用Design-Expert軟件對表2的數(shù)據(jù),進行多元回歸擬合,二次回歸方程為:Y(%)=5.79+0.037A+0.039B+0.33C+0.050D+0.057AB+0.12AC+0.060AD+0.17BC-0.060BD+0.24CD-0.53A2-0.82B2-0.31C2-0.71D2。

圖6　乙醇的體積分?jǐn)?shù)與料液比響應(yīng)面及等高線圖Fig.6　Response surface and contour plots of ethanol concentration and material to liquid ratio

圖7　超聲溫度與料液比響應(yīng)面及等高線圖Fig.7　Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and material to liquid ratio

圖8　超聲時間與料液比響應(yīng)面及等高線圖Fig.8　Response surface and contour plots of ultrasonic time and material to liquid ratio

圖9　超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面及等高線圖Fig.9　Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and ethanol concentration

圖10　超聲時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面及等高線圖Fig.10　Response surface and contour plots of ultrasonic time and ethanol concentration

圖11　超聲時間與超聲溫度響應(yīng)面及等高線圖Fig.11　Response surface and contour plots of ultrasonic time and ultrasonic temperature

2.3.2響應(yīng)面分析根據(jù)Box-Behnken分析得到各因素交互作用對松針總黃酮得率的影響。由等高線圖可知等高線中心位置向邊緣延伸,總黃酮得率逐漸減少,中心位置表示得率最高。另一方面,三維曲面的陡峭程度反應(yīng)出響應(yīng)值隨著實驗條件的改變而改變,曲面越陡峭,實驗條件改變對總黃酮得率影響程度越大,反之,越平緩影響則越小[29]。分析圖7三維曲面圖可以看出,料液比曲面比超聲溫度曲面坡度陡峭,即固定其他因素不變,討論料液比與超聲溫度交互作用對松針總黃酮得率影響大小,改變料液比對總黃酮得率影響較超聲溫度大。同理分析圖9,可以得到固定其他因素不變,改變乙醇體積分?jǐn)?shù)的大小對松針總黃酮得率的影響比改變超聲溫度大,這與二元回歸方程系數(shù)相吻合。等高線的形狀越趨于圓形,表明兩因素的交互作用不顯著,越趨于橢圓形,則交互作用越顯著,趨于橢圓形,且橢圓與兩軸之間形成一定的角度,則交互作用極顯著[30-32],分析圖11超聲時間與溫度交互作用等高線圖趨于橢圓,且橢圓與兩軸之間有一定的角度,因此交互作用極顯著;分析圖9超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用等高線圖較趨于橢圓形且與兩軸有一定角度,交互作用較顯著;同理分析圖7超聲溫度與料液比等高線圖趨于橢圓形,且橢圓形與兩軸之間也存在一定角度,交互作用顯著,其余的不顯著,與方差表分析一致。

2.4　工藝優(yōu)化及驗證實驗

結(jié)合單因素實驗,通過響應(yīng)面法建立二次回歸模型,并通過方差分析,得出提取方法合理可靠。采用響應(yīng)曲面分析可得東北紅松松針黃酮最優(yōu)提取條件:料液比1∶51.6 g/mL,超聲溫度76.27 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)50.87%,超聲時間102.91 min,此時總黃酮得率為5.89%。結(jié)合實驗室操作條件,經(jīng)驗證確定東北紅松松針黃酮提取條件為:料液比1∶52 g/mL,超聲溫度76 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)51%,超聲時間103 min,三次平行實驗取平均值,最后得到總黃酮得率為5.82%。

3　結(jié)論

針對東北地區(qū)豐富的紅松松針資源,以優(yōu)化紅松針黃酮的超聲輔助提取方法為目的,且通過實驗優(yōu)化提取條件,確定最佳提取工藝為:料液比1∶52 g/mL,超聲溫度76 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)51%,超聲時間103 min,總黃酮得率可達(dá)到5.82%,超聲波法輔助乙醇提取東北紅松松針黃酮,成本低,操作簡潔方便。比起傳統(tǒng)的溶劑提取法,超聲波的空穴作用更易使黃酮類物質(zhì)溶出,提高了松針黃酮的提取率,為東北松針資源的開發(fā)利用提供可行性依據(jù)。

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