劉妙錚　趙昌通　張愛華

【摘要】 目的：探究TGF-β/Smad通路成員Smad7在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（nasal inverted papilloma，NIP）中的表達情況，并進一步分析其在該病發(fā)生發(fā)展中的意義。方法：收集NIP標本31例為NIP組，正常下鼻甲（IT）組織標本23例為IT組，鼻腔鱗狀細胞癌（NSCC）標本23例為NSCC組。采用免疫組化SP法檢測Smad7在上述三組中的表達情況。結(jié)果：Smad7在IT中的陽性表達率為13.04%，在NIP中的陽性表達率為48.39%，在NSCC中為86.96%，三組的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=25.154，P=0.000）；NIP組和IT組比較，NIP組和NSCC組比較，IT組和NSCC組比較，差異均有統(tǒng)計學意義

（ 字2=7.422、8.613、25.130，P=0.006、0.003、0.000）。結(jié)論：TGF-β/Smad通路成員Smad7在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。

【關(guān)鍵詞】 TGF-β/Smad； Smad7； 鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤； 鼻腔鱗狀細胞癌

Expression of Smad7 Which Is TGF-β/Smad Pathway Member in Nasal Inverted Papilloma and Its Significance/LIU Miaozheng，ZHAO Changtong，ZHANG Aihua.//Medical Innovation of China，2018，15（06）：028-031

【Abstract】 Objective：To explore the expression of TGF-β/Smad pathway member Smad7 in nasal inverted papilloma（NIP） and to further analyze its significance in the development of NIP.Method：31 cases of NIP were collected as NIP group，23 cases of normal inferior turbinate tissue as IT group，and 23 cases of nasal squamous cell carcinoma（NSCC） as NSCC group.Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of Smad7 in the above three groups.Result：The positive expression rate of Smad7 in IT was 13.04%，in NIP was 48.39%，in NSCC was 86.96%，and there was statistically significant difference among them（字2=25.154，P=0.000）；comparison between NIP group and IT group，comparison between nip group and NSCC group，comparison between IT group and NSCC group，the differences were statistically significant（字2=7.422，8.613，25.130，P=0.006，0.003，0.000）.Conclusion：Smad7 in TGF-β/Smad pathway plays an important role in the development of NIP.

【Key words】 TGF-β/Smad； Smad7； Nasal inverted papilloma； Nasal squamous cell carcinoma

First-authors address：Graduate Department of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.06.008

鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（nasal inverted papilloma，NIP）是最常見的鼻、鼻竇良性上皮性腫瘤，其具備惡性腫瘤特質(zhì)，可出現(xiàn)不同程度的異質(zhì)性，可伴發(fā)育不良、原位癌及鱗狀細胞癌[1]。因其臨床特殊性，故有學者將其歸為交界性腫瘤。TGF-β/Smad通路參與了機體廣泛的生理活動，例如胚胎發(fā)育、細胞增殖、免疫調(diào)節(jié)、細胞凋亡等[2]。近年來，有大量研究認為TGF-β/Smad通路成員的傳導(dǎo)紊亂在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用?，F(xiàn)對該通路的主要成員Smad7在NIP的發(fā)生發(fā)展及惡變中所扮演的角色進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年10月-2017年7月NIP患者手術(shù)完整切除的標本（均為初次手術(shù)切除所得）31例歸為NIP組；鼻中隔矯正術(shù)患者的正常下鼻甲（IT）組織標本23例為IT組；鼻腔鱗狀細胞癌（NSCC）患者（術(shù)前均未行放、化療及免疫治療）手術(shù)切除的標本23例為NSCC組。以上患者均需排除伴隨重大全身性疾病和其他部位腫瘤者，且手術(shù)切除的所有標本均經(jīng)病理科明確診斷。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 上海生工兔抗人Smad7多克隆抗體，福建邁新Kit-5010二抗等。

1.2.2 免疫組化 將標本連續(xù)切片，脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴入一抗，電熱恒溫干燥箱孵育2 h，滴加二抗Kit-5010，再次孵育30 min，上述間隔均需用PBS沖洗，DAB顯色約10 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，最后封片。

1.3 結(jié)果判定 由病理科的兩位醫(yī)師獨立審片，記錄結(jié)果。Smad7的陽性表達是胞質(zhì)和胞核（以胞核為主）出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F塊，切片在高倍顯微鏡下觀察，分別計算陽性細胞百分比和染色強度，并將乘積作為評分標準。（1）陽性細胞百分比≤5%記0分，6%～25%計1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，≥76%記4分。（2）染色強度：1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕褐色。積分≤3分為陰性（-），4～6分為弱陽性（+）；其中7～9分為中度陽性（++），10～12分為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用F檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 NIP組標本中男24例，女7例，年齡37～76歲，平均（57.7±9.5）歲。IT組標本中男14例，女9例，年齡20～52歲，平均（37.7±10.9）歲。NSCC組標本中，男15例，女8例，年齡43～79歲，平均（63.6±7.8）歲。三組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 Smad7在IT、NIP、NSCC中的表達 Smad7在IT中不表達或呈弱陽性（圖1），陽性表達率為13.04%（3/23）；在NIP中染為黃色，定位在胞質(zhì)、胞核，且以核為主（圖2），陽性表達率為48.39%（15/31）；在NSCC中為黃褐色（圖3），陽性表達率為86.96%（20/23）；三組陽性表達率依次遞增，三組的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=25.154，P=0.000）；且NIP組和IT組比較，NIP組和NSCC組比較，IT組和NSCC組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（ 字2=7.422、8.613、25.130，P=0.006、0.003、0.000），見表1。

3 討論

鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤是鼻腔黏膜的良性上皮腫瘤，源于呼吸道黏膜的外胚層內(nèi)翻性生長進入基質(zhì)，可能會出現(xiàn)不同程度的異質(zhì)性，可伴發(fā)育不良、原位癌及鱗狀細胞癌。臨床表現(xiàn)常以單側(cè)鼻塞為主[3]，其次可有流涕、頭痛、鼻竇區(qū)壓痛、面部疼痛，若伴有竇口阻塞可出現(xiàn)膿性分泌物等阻塞性鼻竇炎癥狀，當侵及血管時可出現(xiàn)鼻出血，少數(shù)患者因損傷嗅絲出現(xiàn)短暫或永久性嗅覺減退。NIP組織學屬良性腫瘤，但存在高概率惡變風險，且多數(shù)變?yōu)轺[狀細胞癌。導(dǎo)致惡變的因素很多，病毒感染、工業(yè)原料暴露接觸、吸煙、慢性炎癥等[4]。NIP的惡變是個緩慢過程，可先后出現(xiàn)鱗狀細胞化生、不同程度的異質(zhì)性及發(fā)育不良，最終演變呈鱗狀細胞癌。

近年來，有大量研究認為TGF-β/Smad通路不僅參與了惡性腫瘤的進展同時也在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中擔當了重要角色，EMT可能是促進癌癥轉(zhuǎn)移所必須經(jīng)歷的一個過程[5-6]。TGF-β是個超家族，不僅包含分泌型多肽分子TGF-β，還擁有BMP、抗苗勒管激素、活化素、抑制素、Nodal等[7]。TGF-β在大多數(shù)組織中均有表達，其在體內(nèi)可維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，也能起到一定的抑癌作用，其抑制組織過度增生主要體現(xiàn)在抑制上皮組織、造血組織、神經(jīng)組織上，還可提升免疫系統(tǒng)的耐受性，這在器官移植后免疫排斥的控制方面有潛在的應(yīng)用價值，而對間充質(zhì)來源細胞有促進作用。在人類，TGF-β有3種亞型即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1最為重要，含量也最多。TGF-β受體也有3種，TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ，前兩者在絕大多數(shù)組織內(nèi)都有表達，TβRⅡ可獨立與配體結(jié)合，TβRⅠ則需依賴Ⅱ型受體對配體進行構(gòu)象改造后方可與配體結(jié)合。TβRⅢ不直接參與TGF的信號傳導(dǎo)，主要調(diào)節(jié)配體與受體的結(jié)合[8]。無論是TGF-β還是TβR，在靜息狀態(tài)下均以無活性的單體形式存在，當細胞受到刺激時，兩個單體結(jié)合成二聚體，才具備生物活性，其中TGF-β二聚體先與TβRⅡ二聚體結(jié)合，配體構(gòu)象遂發(fā)生改變，再與TβRⅠ二聚體結(jié)合，形成六聚體穩(wěn)定復(fù)合物，同時也先后激活了TβRⅡ、TβRⅠ胞內(nèi)蛋白激酶活性，TβRⅠ的激活將啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[9]。TGF-β/Smad通路的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)主要由Smad擔當，Smad按其功能分為3類，一類是受體調(diào)節(jié)型R-Smad，可直接與受體結(jié)合，包括Smad1、2、3、5、8；一類是共同結(jié)合型Co-Smad，只有Smad4一種；最后一類是抑制型I-Smad，包括Smad6、7。Smad蛋白的N端和C端各自含有球型結(jié)構(gòu)域MH1、MH2（I-Smad無MH1結(jié)構(gòu)域），連接兩者的為L區(qū)，其中MH1可入核與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。MH2可與TGF-β受體結(jié)合，也可結(jié)合其他調(diào)控因子。Ⅰ型受體活化后與胞內(nèi)對應(yīng)的R-Smad結(jié)合，其中Smad2、3主要參與TGF-β、活化素信號傳導(dǎo)，Smad1、5、8

則主要參與BMPs信號傳導(dǎo)[10]。R-Smad的C端含有一段Ser-X-Ser（SSXS）基序，是TβRⅠ磷酸化位點[11]，磷酸化的R-Smad與Smad4結(jié)合成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進入細胞核，再聯(lián)合其他的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來調(diào)控靶基因的表達[12-13]。I-Smad是該信號抑制通路，Smad7主要抑制TGF-β、活化素、BMP信號傳導(dǎo)；Smad6只對BMP有抑制作用。I-Smad位于細胞核，在受TGF-β、泛素連接酶等刺激后可釋放入到細胞質(zhì)，參與信號的負性調(diào)控。I-Smad無MH1結(jié)構(gòu)域，但有MH2，可與I型受體結(jié)合，但有別于R-Smad的是：其一，兩者是緊密結(jié)合的[14-15]。其二，I-Smad的C端缺少SSXS基序，與受體牢固結(jié)合后不能被磷酸化，也就不能將信號進一步傳遞，這就奠定了I-Smad與R-Smad競爭性結(jié)合受體并抑制TGF-β/Smad通路的基礎(chǔ)。I-Smad負性調(diào)控轉(zhuǎn)錄信號的原理除其可與R-Smad競爭性結(jié)合Ⅰ型受體，還有其他機制。如I-Smad可在細胞核中招募Nedd4L、Smurf1泛素連接酶、Smurf2泛素連酶[16]，并在外界信號刺激下轉(zhuǎn)運出核，與活化的TGF-β、BMP受體結(jié)合，導(dǎo)致受體泛素化而降解，終止信號傳導(dǎo)，與此同時，Smad7也被消耗降解。其次，聚集磷酸酶GADD34-PP1c至活化的Ⅰ型受體ALK5上使受體去磷酸化而失活[17]。此外，Smad7可直接在細胞核發(fā)揮作用，抑制特定基因轉(zhuǎn)錄。

TGF-β/Smad通路在大多數(shù)細胞中起腫瘤抑制作用，而Smad7又是該通路的抑制信號，故當Smad7失去機體正常調(diào)控時，就會使腫瘤逃脫TGF-β/Smad通路的抑瘤作用，最終導(dǎo)致癌癥的擴增、轉(zhuǎn)移及進一步發(fā)展[18]。現(xiàn)有大部分研究報道在肺鱗癌組織、乳腺癌、胃癌、胰腺癌中可見Smad7的過度表達。在本文的研究中，Smad7在NIP組陽性表達率為48.39%（15/31）、在NSCC組為86.96%（20/23），均高于IT組的13.04%（3/23），三組比較差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=25.154，P=0.000）。將上述三組兩兩比較，NIP組和IT組比較，NIP組和NSCC組比較，IT組和NSCC組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（ 字2=7.422、8.613、25.130，P=0.006、0.003、0.000）。由此可以猜測NIP作為鼻腔的良性腫瘤，其具備了惡性腫瘤的特質(zhì)，發(fā)展過程可能是由于正常組織受到外界刺激及自身內(nèi)環(huán)境紊亂導(dǎo)致NIP的發(fā)生，若機體持續(xù)暴露在此狀態(tài)下，會進一步激起機體各通路的傳導(dǎo)障礙，使病變組織進一步發(fā)展，發(fā)生鱗狀化生、異質(zhì)性、原位癌甚至最終演變成鼻腔鱗癌。本文研究的Smad7及TGF-β/Smad

通路可能也參與了上述的演變過程，這條通路在大多數(shù)細胞中起腫瘤抑制作用是有賴于該通路成員的正常表達及傳導(dǎo)，如Smad7，當其表達異常就會導(dǎo)致TGF-β/Smad通路的抑癌作用受到抑制，進而腫瘤細胞大量復(fù)制，在后期甚至利用異常的TGF-β/Smad通路和其他相關(guān)通路促進血管生成和誘導(dǎo)EMT[19]，進行惡性增殖、轉(zhuǎn)移。

NIP是鼻腔腫瘤中較為特殊的一類，具有高風險向NSCC轉(zhuǎn)化的可能，尤其是年長者和經(jīng)歷多次手術(shù)者[20]，因此吸引較多學者對其病因?qū)W進行研究，但至今，仍在探索中。本試驗就其TGF-β/Smad通路中的Smad7因子進行了探索，但對該通路的其他成員，尤其是處于多條通路交叉口的因子，還需進一步研究深入，為未來NIP的治療指明高效的免疫學方向。

參考文獻

[1] Safadi A，Yafit D，Abu-Ghanem S，et al.The clinical behavior of sinonasal inverted papilloma with cellular dysplasia：case series and review of the literature[J].Eur Arch Otorhinolaryngol，2017，274（9）：3375-3382.

[2] Tan R J，Zhou D，Liu Y.Signaling Crosstalk between Tubular Epithelial Cells and Interstitial Fibroblasts after Kidney Injury[J].Kidney Diseases，2016，2（3）：136.

[3] Salomone R，Matsuyama C，F(xiàn)ilho O G，et al.Bilateral inverted papilloma：case report and literature review[J].Brazilian Journal of Otorhinolaryngology，2008，74（2）：293-296.

[4] Re M，Gioacchini F M，Bajraktari A，et al.Malignant transformation of sinonasal inverted papilloma and related genetic alterations：a systematic review[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol，2017，274（8）：2991-3000.

[5] Heldin C H，Moustakas A.Role of Smads in TGFβ signaling[J].Cell & Tissue Research，2012，347（1）：21-36.

[6] Smith B N，Bhowmick N A.Role of EMT in Metastasis and Therapy Resistance[J].Journal of Clinical Medicine，2016，5（2）：17.

[7] Weiss A，Attisano L.The TGFbeta superfamily signaling pathway[J].Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology，2013，2（1）：47-63.

[8] Stenvers K L，Tursky M L，Harder K W，et al.Heart and liver defects and reduced transforming growth factor β2 sensitivity in transforming growth factor beta type Ⅲ receptor-deficient embryos[J].Molecular & Cellular Biology，2003，23（12）：4371-4385.

[9] Zú?iga J E，Groppe J C，Cui Y，et al.Assembly of TbetaRI：TbetaRII：TGFbeta ternary complex in vitro with receptor extracellular domains is cooperative and isoform-dependent[J].Journal of Molecular Biology，2005，354（5）：1052-1068.

[10] Pardali E，Goumans M J，Ten D P.Signaling by members of the TGF-β family in vascul ar morphogenesis and disease.[Review][98 refs][J].Trends in Cell Biology，2010，20（9）：556-567.

[11] Massagué J.TGFβ signalling in context[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2012，13（10）：616-630.

[12] Moustakas A，Heldin C H.The regulation of TGFβ signal transduction[J].Development，2009，136（22）：3699.

[13] Torbenson M，Marinopoulos S，Dang D T，et al.Smad4 overexpression in hepatocellular carcinoma is strongly associated with transforming growth factor betaⅡ receptor immunolabeling[J].Human Pathology，2002，33（9）：871-876.

[14] Imamura T M，Takase M，Nishihara A，et al.Smad6 inhibits signaling by the TGF-β superfamily[J].Nature，1997，389（6651）：622-626.

[15] Nakao A，Afrakhte M，Morn A，et al.Identification of Smad7，a TGFbeta-inducible antagonist of TGF-beta signalling[J].Nature，1997，389（6651）：631-635.

[16] Inoue Y，Imamura T.Regulation of TGF-beta family signaling by E3 ubiquitin ligases[J].Cancer Science，2008，99（11）：2107-2112.

[17] Shi W，Sun C，He B，et al.GADD34-PP1c recruited by Smad7 dephosphorylates TGF-β typeⅠ receptor[J].Journal of Cell Biology，2004，164（2）：291-300.

[18] Fei S，Li X，Kai Y，et al.Expression of VEGF-D，SMAD4，and SMAD7 and Their Relationship with Lymphangiogenesis and Prognosis in Colon Cancer[J].Journal of Gastrointestinal Surgery，2016，20（12）：1-9.

[19] Katsuno Y，Lamouille S，Derynck R.TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression[J].Current Opinion in Oncology，2013，25（1）：76-84.

[20] Yamashita Y，Uehara T，Hasegawa M，et al.Squamous cell carcinoma antigen as a diagnostic marker of nasal inverted papilloma[J].American Journal of Rhinology & Allergy，2016，30（2）：122.

（收稿日期：2017-11-09） （本文編輯：張爽）