任廣旭,伊素芹,張鴻儒,王靖*

1(農(nóng)業(yè)部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所，北京，100081) 2(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院雙蛋白工程研究中心，北京，100081)3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與營(yíng)養(yǎng)功能風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試驗(yàn)室，北京，100081)

過(guò)量運(yùn)動(dòng)和不規(guī)律作息均能造成不同程度的疲勞。運(yùn)動(dòng)型疲勞是連續(xù)性超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)刺激所引發(fā)的一種生理現(xiàn)象[1]。第五屆國(guó)際運(yùn)動(dòng)生化學(xué)會(huì)將疲勞定義為機(jī)體生理過(guò)程不能維持其機(jī)能在特定水平上或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。劇烈運(yùn)動(dòng)機(jī)體需要消耗大量能量物質(zhì)，細(xì)胞從有氧呼吸提供能量轉(zhuǎn)換成無(wú)氧酵解供能。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)度的增加，機(jī)體產(chǎn)生大量乳酸、內(nèi)環(huán)境酸堿度和滲透壓失調(diào)，最終導(dǎo)致機(jī)體不能有效維持現(xiàn)有的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，出現(xiàn)力竭現(xiàn)象。因此，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充使機(jī)體快速消除疲勞，提高運(yùn)動(dòng)能力是當(dāng)今運(yùn)動(dòng)科學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。大豆蛋白和乳清蛋白均屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，具有多種生物調(diào)節(jié)功能[2]。研究揭示以大豆蛋白和牛乳蛋白組成的混合白能夠有效促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及蛋白合成[3-4]。單一蛋白源以及混合蛋白對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的影響目前尚不清楚，本研究將利用wistar大鼠負(fù)重游泳模型對(duì)此進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1　動(dòng)物與分組

6周齡SPF級(jí)雄性wistar大鼠18只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證NO.11400700105348、生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2010-0001。采用IVC大鼠飼養(yǎng)系統(tǒng)，12 h光照周期，嚴(yán)格遵守中國(guó)動(dòng)物實(shí)用指南。體重202～226 g，隨機(jī)分為3組：乳清蛋白組、大豆分離蛋白組和雙蛋白組。

1.2　動(dòng)物模型

運(yùn)動(dòng)模型采用wistar大鼠一次性力竭游泳模型。將大鼠置于2倍于身長(zhǎng)的游泳筒[水溫(25±0.5) ℃]中游泳，尾部負(fù)重自身體重10%的鉛皮，記錄大鼠自游泳開(kāi)始至力竭發(fā)生的時(shí)間(s)，力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠全身沉入水中10 s后仍不能通過(guò)努力返回水面[5-6]。

1.3　主要材料

大豆分離蛋白：采購(gòu)于山東禹王集團(tuán)，食品級(jí)大豆分離蛋白，干蛋白質(zhì)含量>90%。乳清蛋白：采購(gòu)于美國(guó)Hilmar，食品級(jí)乳清蛋白，干蛋白質(zhì)含量為94.6%。SPF級(jí)維持飼料，購(gòu)于北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

1.4　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用wistar大鼠被隨機(jī)分成3組，并通過(guò)耳標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記。首先，對(duì)所有大鼠進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼喂，第2周檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠體重，計(jì)算負(fù)重游泳所需鉛皮重量。每周一進(jìn)行1次性力竭訓(xùn)練，周二～周五進(jìn)行2/3力竭時(shí)間的普通游泳運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)后分別對(duì)3組大鼠進(jìn)行灌胃處理(濃度100 mg/mL，2 mL/只)。連續(xù)飼喂6周，第7周(周一)一次性力竭后灌胃，分別在灌胃后第30、60、90、120和150 min采集尾靜脈血。

1.5　檢測(cè)指標(biāo)

血液生理生化測(cè)定：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采集完不同時(shí)間點(diǎn)的尾靜脈血，收集血清檢測(cè)肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)。肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，并且按照實(shí)試劑盒說(shuō)明書(shū)所示程序進(jìn)行操作。一次性力竭時(shí)間測(cè)定：第7周記錄每只大鼠力竭的時(shí)間。

1.6　統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，p<0.05為差異就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　大鼠體重變化情況

本實(shí)驗(yàn)選擇體重均一的SPF級(jí)wistar大鼠，每只大鼠每天定量飼喂20 g SPF級(jí)大鼠維持飼料，自由飲水。在負(fù)重游泳訓(xùn)練后，每組大鼠分別通過(guò)灌胃攝入等量的蛋白質(zhì)(乳清蛋白、大豆分離蛋白和雙蛋白)。經(jīng)過(guò)6周的靜水游泳訓(xùn)練及蛋白灌胃處理，第7周檢測(cè)各組大鼠體重。檢測(cè)結(jié)果表明，各蛋白干預(yù)組之間大鼠體重沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)，乳清蛋白干預(yù)組大鼠平均體重為360.83 g，略高于大豆分離蛋白組(平均體重339.83 g)和雙蛋白組(平均體重344.50 g)。

表1　wistar大鼠體重變化情況表Table 1　The weight change of wistar rats (n=6，±s)

2.2　雙蛋白對(duì)大鼠一次性力竭時(shí)間的影響

根據(jù)第7周3組大鼠體重?cái)?shù)值，按照體重10%負(fù)重原則計(jì)算尾部鉛皮重量，分別對(duì)每組大鼠進(jìn)行負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。記錄每只大鼠達(dá)到力竭狀態(tài)的時(shí)間，乳清蛋白組平均力竭時(shí)間為88 s，標(biāo)準(zhǔn)差為21.7、大豆分離蛋白組平均力竭時(shí)間為99.8 s，標(biāo)準(zhǔn)差為10.7、雙蛋白組平均力竭時(shí)間為135.8 s標(biāo)準(zhǔn)差為16.2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析雙蛋白組大鼠達(dá)到力竭狀態(tài)的品均時(shí)間顯著高于乳清蛋白組和大豆分離蛋白組(p<0.05)，乳清蛋白組與大豆分離蛋白組之間平均力竭時(shí)間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1　大鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間Fig.1　The exhaustive swimming time

2.3　雙蛋白對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肌酸激酶的影響

肌酸激酶是機(jī)體ATP-CP系統(tǒng)代謝的關(guān)鍵酶，它能夠催化ATP生產(chǎn)ADP和磷酸肌酸，為細(xì)胞提供運(yùn)動(dòng)所需的能量[7]。肌酸激酶在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中變化比較敏感，其含量的多少常用于評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度大小。經(jīng)過(guò)6周的運(yùn)動(dòng)飼喂干預(yù)實(shí)驗(yàn)，第7周每組大鼠進(jìn)行一次性力竭負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，分別在0、30、60、90、120、150 min采集尾靜脈血，檢測(cè)肌酸激酶的含量。運(yùn)動(dòng)前(0 min)3組大鼠肌酸激酶本底水平相同沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，“運(yùn)動(dòng)+蛋白干預(yù)”后30、90 min各組肌酸激酶含量明顯高于60、120 min。3組之間肌酸激酶變化趨勢(shì)一致，表明各組大鼠運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度基本一致(表1)。

2.4　雙蛋白對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠乳清脫氫酶的影響

乳酸是體內(nèi)糖原在缺氧條件下氧化分解的代謝產(chǎn)物，乳酸的堆積是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的物質(zhì)之一。乳酸脫氫酶廣泛存在于機(jī)體組織細(xì)胞中，能夠催化乳酸與丙酮酸之間轉(zhuǎn)換。結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)前，3組大鼠乳清脫氫酶活性相同沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，“運(yùn)動(dòng)+蛋白”干預(yù)后第30 min雙蛋白組乳酸脫氫酶活性明顯升高，而乳清蛋白組與大豆分離蛋白組升高趨勢(shì)一致，顯著低于雙蛋白組(p<0.05)。隨后到第60 min，雙蛋白組乳酸脫氫酶活性急劇降低至與其他2組一致水平。從60～150 min 3組大鼠血清乳酸脫氫酶活性沒(méi)有明顯差異，150 min時(shí)各組大鼠基本恢復(fù)到靜息狀態(tài)(圖2)。

表2　wistar大鼠肌酸激酶動(dòng)態(tài)變化情況表Table 2　Analysis of creatine kinase(n=6，±s)

圖2　大鼠乳酸脫氫酶活性動(dòng)態(tài)變化Fig.2　The dynamic change of lactic acid dehydrogenase

3　討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞不僅僅發(fā)生在職業(yè)運(yùn)動(dòng)員群體之中，當(dāng)今大學(xué)生、都市健身人群及普通上班族中都存在運(yùn)動(dòng)性疲勞。導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的機(jī)制尚不清楚，學(xué)術(shù)界目前存在以下幾種學(xué)說(shuō)[8]：(1)能量衰竭學(xué)說(shuō)。主要認(rèn)為在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中機(jī)體消耗大量的能量物質(zhì)，這些物質(zhì)不能及時(shí)得到補(bǔ)充，從而造成疲勞。(2)代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說(shuō)。主要認(rèn)為運(yùn)動(dòng)過(guò)程中機(jī)體從有氧功能轉(zhuǎn)化成無(wú)氧酵解，機(jī)體產(chǎn)生大量乳酸和氨[9]，造成機(jī)體穩(wěn)態(tài)失調(diào)。(3)自由基攻擊學(xué)說(shuō)。主要認(rèn)為運(yùn)動(dòng)能力消耗伴隨大量自由基產(chǎn)生，機(jī)體不能及時(shí)清除使自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧反應(yīng)，造成細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變。如果不能及時(shí)消除運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的疲勞，容易影響患者身心健康?，F(xiàn)存消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的方法主要有物理療法和藥物療法，這些療法都存在一些弊端。以按摩為代表的物理療法只能短暫緩解運(yùn)動(dòng)疲勞，不能長(zhǎng)期改變疲勞狀態(tài)。藥物療法耗時(shí)，往往對(duì)身體也會(huì)產(chǎn)生一些副作用。因此，如何通過(guò)飲食緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞成為食品科學(xué)、運(yùn)動(dòng)科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所關(guān)注的焦點(diǎn)。

負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)模型通常應(yīng)用在運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)研究領(lǐng)域[10]。因此，本研究將利用wistar大鼠構(gòu)建負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)模型，開(kāi)展乳清蛋白，大豆蛋白以及混合蛋白的功能評(píng)價(jià)。研究顯示肌肉蛋白的堆積主要發(fā)生在運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù)期，因此本研究所涉及的蛋白營(yíng)養(yǎng)干預(yù)都在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練完成后，通過(guò)灌胃的方式進(jìn)行[11]。自然膳食參照陳巍兩年飼喂試驗(yàn)中wistar大鼠的攝食量[12]，最終確定每只大鼠每天維持飼料為20 g，使得6周運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)期間大鼠日常膳食攝入量保持一致。第7周，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有大鼠體重一致，這種體重的均一除了認(rèn)為的控制食物的攝入量，還有每周持續(xù)性的游泳運(yùn)動(dòng)有關(guān)，因此研究發(fā)現(xiàn)這種運(yùn)動(dòng)能夠穩(wěn)定大鼠的體重[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)按照體重10%計(jì)算負(fù)重游泳鉛皮重量，所達(dá)到的效果最好[14]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)采取雙盲法，即力竭時(shí)間獲取由獨(dú)立的技術(shù)人員獲取，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性。

通過(guò)連續(xù)6周的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)發(fā)現(xiàn)，單一蛋白源(乳清蛋白及大豆分離蛋白)干預(yù)組的大鼠運(yùn)動(dòng)能力，沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在以動(dòng)植物混合蛋白干預(yù)的大鼠中，發(fā)現(xiàn)其平均力竭實(shí)現(xiàn)顯著地高于單一蛋白源。這一現(xiàn)象可能是由以下幾個(gè)因素綜合作用的結(jié)果。首先，大豆與乳清蛋白消化吸收效率不一致。乳清蛋白屬于快速降解蛋白[15]，機(jī)體在攝入乳清蛋白后30 min內(nèi)出現(xiàn)高氨基酸血癥狀[14]。而大豆蛋白的消化效率相比乳清蛋白較慢，前期氨基酸釋放較慢，但攝入后能夠保持較高水平的氨基酸供給[14，16]?；旌系鞍椎陌被釀t能夠綜合兩者在氨基酸釋放方面的優(yōu)勢(shì)，能夠保證持續(xù)性的氨基酸供給[14]。尤其是支鏈氨基酸，它在肌肉蛋白質(zhì)合成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17]。其次，乳清蛋白不含有抗氧化物質(zhì)。大豆蛋白中較多的抗氧化物質(zhì)[18]?；旌系鞍撞坏軌虬l(fā)揮氨基酸供給優(yōu)勢(shì)，而且能夠兼顧抗氧化物質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性的運(yùn)動(dòng)能夠造成運(yùn)動(dòng)疲勞，可以反應(yīng)在血漿中的酶含量，如乳酸脫氫酶和肌酸激酶[19-20]。通過(guò)采集尾靜脈血，發(fā)現(xiàn)3組不同干預(yù)下肌酸激酶的活性變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明各組運(yùn)動(dòng)強(qiáng)基本一致[21]。在相同條件下，雙蛋白組營(yíng)養(yǎng)干預(yù)組大鼠平均力竭時(shí)間顯著長(zhǎng)于其他2組。這種差異也體現(xiàn)在血清乳酸脫氫酶活性水平，雙蛋白攝入30 min時(shí)大鼠外周血乳酸脫氫酶含量最高，60 min后恢復(fù)至其他2組一致的水平。說(shuō)明蛋白組運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)攝入后30 min內(nèi)乳酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)化活動(dòng)比較頻繁。

綜上所述，通過(guò)連續(xù)6周的wistar運(yùn)動(dòng)飼喂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后攝入動(dòng)植物混合蛋白能顯著提高大鼠負(fù)重游泳平均力竭時(shí)間，具有顯著地抗疲勞功效。本研究結(jié)果將為運(yùn)動(dòng)疲勞人群制定合理飲食方案提供科學(xué)支撐。

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