劉洋，張欣，陳建國，梁寒峭，程池*，伊地知 哲生，大盛 達(dá)也

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(日本 Combi株式會(huì)社，埼玉，3380832)

糞腸球菌Enterococcusfaecalis分類學(xué)上歸屬乳桿菌目(Lactobacillales)，腸球菌科(Enterococcaceae)，腸球菌屬(Enterococcus)[1]，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)常見菌之一，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，以及具有抑制病原菌、增強(qiáng)免疫力等作用。糞腸球菌作為一種益生菌，被納入益生菌 IDF 455-2012名單中，在醫(yī)藥和食品工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2]。糞腸球菌EC-12是日本Combi株式會(huì)社多年研制成功的一款滅活型乳酸菌，暢銷日本二十多年。科學(xué)研究表明，滅活后的EC-12具有增強(qiáng)免疫力、調(diào)理腸道菌群、改善便秘、抑制花粉癥、抗腫瘤等作用[3-7]。

糞腸球菌Enterococcusfaecalis雖然對(duì)維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境起著不可忽視的作用，但是在特定條件下也會(huì)引起機(jī)體發(fā)生疾病，且糞腸球菌往往產(chǎn)生耐藥性，已引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)、食品、飼料等行業(yè)的重點(diǎn)關(guān)注。其中糞腸球菌Enterococcusfaecalis對(duì)萬古霉素的耐藥性一直是研究熱點(diǎn)之一。萬古霉素耐藥基因主要包括vanA、vanB和vanC。vanA、vanB為介導(dǎo)萬古霉素高水平耐藥的獲得性耐藥基因，且具有耐藥基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。VanA型是腸球菌中最常見耐藥型，VanC型屬于固有耐藥性，耐藥基因位于細(xì)菌染色體[8]。此外也有報(bào)道vanD, vanE和 vanG型等萬古霉素耐藥腸球菌，但這些基因型菌株并不常見[9-11]。

耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE)的檢測方法主要有紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法、瓊脂篩選法和分子生物學(xué)等方法[12-13]。本研究利用PCR方法，對(duì)糞腸球菌EC-12進(jìn)行萬古霉素vanA、vanB、vanC以及vanD、vanE和vanG耐藥基因進(jìn)行特異性靶向檢測，了解其是否攜帶耐藥基因及其類型，評(píng)價(jià)其在萬古霉素耐藥基因水平上的安全性。

1　材料與方法

1.1　菌株

1.1.1對(duì)照菌株

屎腸球菌EnterococcusfaeciumCICC 24252(攜帶vanA基因)、糞腸球菌EnterococcusfaecalisCICC 24243(攜帶vanB基因)、雞腸球菌EnterococcusgallinarumCICC 24240(攜帶vanC1基因)、鉛黃腸球菌EnterococcuscasseliflavusCICC 24239(攜帶vanC2/3基因)和糞腸球菌EnterococcusfaecalisCICC 23530(陰性對(duì)照菌)，上述菌株均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供。

1.1.2樣品菌株

糞腸球菌EnterococcusfaecalisEC-12，由日本Combi株式會(huì)社提供的滅活型菌粉。

1.2　主要儀器和試劑

PCR儀，德國Biometra；電泳儀，美國BIO-RAD；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司； PCR MasterMix和DL 2000 Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.3　方法

1.3.1DNA提取

對(duì)照菌株經(jīng)MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獲得DNA。取0.1 g菌株EC-12的凍干菌粉，用1.0 mL TE緩沖液溶解，再取0.2 mL混合液用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獲得DNA。

1.3.2PCR反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系： 2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL?？瞻讓?duì)照模板以1.0 μL ddH2O代替。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min, 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min ，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3引物選擇

選擇萬古霉素耐藥基因型保守基因(vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3)的多對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR試驗(yàn)， 最終選用能夠擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶，且不同產(chǎn)物條帶大小能夠區(qū)分的引物作為本方法檢測vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3型耐藥基因的特異引物。另外，參照DEPARDIEU F等人的方法[16]，PCR檢測樣品菌株的vanD、vanE和vanG型耐藥基因。PCR方法選用引物詳見表1。

表1　PCR引物及擴(kuò)增片段長度Table 1　Specific PCR primers and length of amplified fragments

1.3.4電泳檢測

取PCR產(chǎn)物8 μL點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，設(shè)置電泳參數(shù)：電壓120 V， 時(shí)間25 min。電泳結(jié)束后放置凝膠成像系統(tǒng)紫外照射成像。

1.3.5陽性對(duì)照菌株的鑒定及耐藥類型的確認(rèn)

陽性對(duì)照菌株分別PCR擴(kuò)增相應(yīng)的萬古霉素耐藥基因，電泳檢測是否擴(kuò)增出單一的目的條帶，同時(shí)對(duì)陽性條帶進(jìn)行測序，獲得的序列提交至GenBank，并與NCBI中萬古霉素耐藥基因序列進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，確認(rèn)耐藥基因類型。同時(shí)利用16S rRNA和pheS基因[17]對(duì)陽性對(duì)照菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，明確其分類名稱。

1.3.6EC-12耐藥基因檢測

應(yīng)用建立的PCR方法對(duì)樣品菌株EC-12進(jìn)行萬古霉素耐藥基因檢測。

2　結(jié)果

2.1　對(duì)照菌株P(guān)CR檢測及測序鑒定結(jié)果

萬古霉素耐藥基因檢測顯示，CICC 24 252擴(kuò)增vanA基因陽性，電泳檢測清晰可見1 030 bp單一條帶，與vanA基因序列的相似性為99%。CICC 24 243擴(kuò)增vanB陽性，電泳檢測清晰可見536 bp單一條帶，與vanB基因序列的相似性為99%。CICC 24 240擴(kuò)增vanC1基因陽性，電泳檢測清晰可見822 bp單一條帶，經(jīng)測序比對(duì)，與vanC1基因序列的相似性為99%。CICC 24 239擴(kuò)增vanC2/3基因陽性，電泳檢測清晰可見484 bp單一條帶，經(jīng)測序比對(duì)，與vanC2/3基因序列的相似性為99%。因此，利用萬古霉素耐藥基因特異引物，4株陽性菌株分別攜帶4種類型耐藥基因，引物特異性、靈敏度良好，可以用于萬古霉素耐藥基因檢測用陽性質(zhì)控菌。16S rRNA結(jié)合pheS基因分析表明，CICC 24 252為屎腸球菌Enterococcusfaecium，CICC 24 243為糞腸球菌Enterococcusfaecalis，CICC 24 240為雞腸球菌Enterococcusgallinarum，CICC 24 239為鉛黃腸球菌Enterococcuscasseliflavus?；蛐蛄械顷懱?hào)及鑒定結(jié)果見表2。

表2　陽性對(duì)照菌株測序確認(rèn)結(jié)果Table 2　Sequencing and identification results of the positive control strains

2.2　EC-12的耐藥基因檢測結(jié)果

如圖1、圖2所示，陽性對(duì)照菌株均能擴(kuò)增出相應(yīng)的耐藥基因序列，EC-12的vanA、vanB、vanC1、vanC2 /C3、vanD、vanE和vanG基因擴(kuò)增均為陰性。

M-D2000 Marker; S-EC-12; N-CICC 23530(陰性對(duì)照菌); C-空白對(duì)照; P1-CICC 24252(vanA陽性對(duì)照菌);P2-CICC 24243(vanB陽性對(duì)照菌);P3-CICC 24240(vanC1陽性對(duì)照菌); P4-CICC 24239(vanC2/3陽性對(duì)照菌)圖1　樣品菌株EC-12 DNA的耐藥基因(vanA、vanB、vanC1和vanC2/C3)擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1　Specific amplified results of vancomycin resistant genes (vanA,vanB,vanC1 and vanC2/C3) from strain EC-12

M-D2000 Marker; S-EC-12; N-CICC 23530(陰性對(duì)照菌); C-空白對(duì)照?qǐng)D2　樣品菌株EC-12 DNA的耐藥基因(vanD、vanE和vanG)擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2　Specific amplified results of vancomycin resistantgenes (vanD, vanE and vanG) from strain EC-12

3　討論

人們對(duì)腸球菌的利用以糞腸球菌和屎腸球菌為主，其安全及益生特性被越來越多的研究所證實(shí)[18-19]。國內(nèi)暢銷的許多微生態(tài)制劑組方中包含了糞腸球菌和屎腸球菌，例如媽咪愛和美常安(枯草芽孢桿菌和屎腸球菌)、思連康和普樂拜耳(嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和蠟樣芽孢桿菌)等。而在食品工程領(lǐng)域，以日本Combi株式會(huì)社研制的糞腸球菌EnterococcusfaecalisEC-12應(yīng)用最為廣泛。

耐萬古霉素腸球菌通常出現(xiàn)在臨床領(lǐng)域，隨著萬古霉素等抗生素的使用，菌株的獲得性耐藥和耐藥程度不斷提高，WHO已將萬古霉素耐藥腸球菌列為高度耐藥性病原菌。對(duì)萬古霉素腸球菌的檢測目前主要集中在醫(yī)學(xué)感染性腸球菌，對(duì)食品用途或益生性腸球菌的耐藥基因檢測鮮有研究。而本研究以糞腸球菌EnterococcusfaecalisEC-12為材料，采用PCR方法對(duì)EC-12的萬古霉素耐藥基因進(jìn)行了篩查，結(jié)果顯示其vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3、vanD、vanE和vanG基因擴(kuò)增均為陰性，體現(xiàn)其在主要萬古霉素耐藥基因水平上的安全性。

綜上，目前腸球菌在國內(nèi)外醫(yī)藥、食品工程、飼料工業(yè)等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，但腸球菌存在耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)較大，應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)學(xué)、食品及飼料用腸球菌的耐藥性檢測，科學(xué)評(píng)價(jià)其安全性，保障腸球菌制品的安全性。

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