劉鳳銀,張媚健,李 軒,謝麗君,袁學(xué)文,黃燕璇,梁 岳,穆洪濤,*

(1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣東廣州 510310;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,北京 100050;3.廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系,廣東廣州 510310)

亞硝酸鹽具有氧化性,常作為護色劑、防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中[13]。但研究發(fā)現(xiàn),亞硝酸鹽可使血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,失去運氧的功能,短期大量攝入可導(dǎo)致組織缺氧甚至死亡[45]。此外,亞硝酸鹽可與體內(nèi)的胺類物質(zhì)反應(yīng)生成“亞硝胺”,后者具有致癌作用,長期過量攝入易誘發(fā)食道癌、胃癌和腸癌等[6]。亞硝酸鹽作為生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的一個自然組成部分,廣泛存在于天然水體中。但工業(yè)廢水、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、運輸管道等污染,會導(dǎo)致水體中亞硝酸鹽含量大幅度升高[78]。世界衛(wèi)生組織規(guī)定每日允許亞硝酸鹽攝入量不得超過0.2 mg/kg·bw[9];我國衛(wèi)生部2017年出臺的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》,規(guī)定礦泉水中亞硝酸鹽含量不能超過0.1 mg/L[10]。

我國對食品安全高度重視,隨著抽檢覆蓋率提高,快速檢測作為實驗室檢測的有益補充,可實現(xiàn)大量樣品的現(xiàn)場篩查,增加樣品檢測數(shù)量,擴大食品安全控制范圍,大大提高監(jiān)管效率[1112]。目前已報道的亞硝酸鹽快速檢測方法主要有試紙法[1315]和速測管法[16],它們都具有快速、簡便等優(yōu)點,但靈敏度低,只能定性或半定量檢測,且無法進行高通量檢測,限制了應(yīng)用。鄭曉宏等報道了一種微孔板法,實現(xiàn)了對亞硝酸鹽的定量、高通量檢測,但該方法采用氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺雙顯色劑,但步驟多、操作繁雜、耗時長、干擾因素多等[17]。李永芳等[18]研究發(fā)現(xiàn),間苯二胺可獨立作為重氮化偶聯(lián)試劑,用于亞硝酸鹽的檢測,其原理是利用間苯二胺的兩個伯氨基,其中一氨基先與亞硝酸鹽發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽,再利用分子的另一氨基,發(fā)生分子內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng),生成橙紅色環(huán)偶氮亞氨基苯，該研究采用單一試劑作為重氮化偶聯(lián)試劑,具有靈敏、快速、穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點,但無法實現(xiàn)高通量檢測。

本研究擬以微孔板為載體,采用間苯二胺作為顯色劑,通過確定最佳測定波長、優(yōu)化工作條件,以期建立一種高通量檢測方法,用于飲用水等食品中亞硝酸鹽殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞硝酸鈉 優(yōu)級純;間苯二胺、鹽酸、亞硫酸鈉、亞鐵氰化鉀、碘化鉀、氯化鈣、氯化鈷、氯化鋁、硫酸鎳、氯化銨、氯化鎂、溴化鈉、乙酸鋅、硝酸鈉、硼酸鈉、硫酸銅、氯化鉻 均為分析純;實驗用水 屈臣氏蒸餾水。

SPMax 2300A2光吸收型全波長酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司;JA2603B(M)分析天平(0.1 mg) 上海精科科學(xué)儀器有限公司;微量移液器 德國艾本德股份公司;DHG9140AD鼓風(fēng)干燥箱 上海東麓儀器設(shè)備有限公司;96孔微孔板 廈門怡佳美實驗器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最佳測定波長確定 將間苯二胺用0.5 mol/L鹽酸溶解稀釋,配制間苯二胺顯色劑(20 g/L)。以96孔微孔板為載體,使用移液器將5 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、間苯二胺顯色劑加入微孔板中混合,兩者的體積比為1∶9,分別為25、225 μL。反應(yīng)10 min后,對反應(yīng)后的體系在400～800 nm處進行全波長掃描。選擇吸光值最大的波長作為最佳測定波長。

1.2.2 單因素實驗 與5 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進行顯色反應(yīng),采用酶標(biāo)儀,測定各孔吸光值A(chǔ)451 nm。固定間苯二胺顯色劑濃度為20 g/L,反應(yīng)時間為10 min,考察鹽酸濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)對顯色效果的影響;固定鹽酸濃度為0.4 mol/L,反應(yīng)時間為10 min,考察顯色劑濃度(10、20、30、40、50、60 g/L)對顯色效果的影響;固定鹽酸濃度為0.4 mol/L,間苯二胺顯色劑濃度為30 g/L,考察反應(yīng)時間(2、5、10、15、20、30 min)對顯色效果的影響。

1.2.3 正交實驗 以鹽酸濃度、顯色劑濃度、反應(yīng)時間為考察因素,吸光值A(chǔ)451 nm為指標(biāo),根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,進行3因素3水平正交實驗。正交實驗因素水平設(shè)置見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、5 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液,在最佳顯色條件下進行顯色反應(yīng)。以亞硝酸鈉濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 檢出限 吸取20份空白水樣,進行測定。計算空白值的平均值B0及其標(biāo)準(zhǔn)差SDB0。按照下式計算檢出限(LOD)。

LOD=B0+3SDB0

式(1)

1.2.7 空白添加回收實驗 取18等份空白水樣分為3組進行6等份樣品平行實驗,分別以0.05、0.10、0.15 mg/L三個不同亞硝酸鈉濃度水平進行測定。按照以下公式計算空白加標(biāo)回收率及變異系數(shù)。

式(2)

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗做3個平行實驗,實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Excel計算數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差;采用SPSS 19.0進行正交實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)方差分析;采用Origin 8.5對數(shù)據(jù)進行擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳測定波長確定

由圖1可知,反應(yīng)后體系在451 nm處具有最大吸收峰。因此,選擇451 nm作為最佳測定波長。

圖1 反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectrum curve of reaction product

2.2 工作條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 鹽酸濃度對顯色效果的影響 亞硝酸鹽與間苯二胺重氮化顯色反應(yīng)需在強酸條件下進行,鹽酸濃度會影響顯色反應(yīng)的效果。吸取5 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同鹽酸濃度下進行顯色反應(yīng),采用酶標(biāo)儀于451 nm處測定吸光值,結(jié)果見圖2。隨著鹽酸濃度的升高,吸光值先增大后減小,0.4 mol/L時,反應(yīng)最為充分,吸光值最大。

圖2 鹽酸濃度對顯色效果的影響Fig.2 Effect of concentration of hydrochloric acid on chromogenic reaction注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖3、圖4同。

2.2.1.2 顯色劑濃度對顯色效果的影響 吸取5 mg/L亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液與不同濃度的間苯二胺顯色劑進行顯色反應(yīng),結(jié)果見圖3。在間苯二胺濃度為30 g/L時,具有穩(wěn)定最大吸光值,濃度低或者高于30 g/L時,吸光值逐漸減小?？赡茉蚴?顯色劑濃度過低,顯色不充分,吸光值偏低;顯色劑濃度過高,過量的顯色劑被空氣氧化為褐色,對實驗測定產(chǎn)生了干擾,吸光值降低[19]。

圖3 顯色劑濃度對顯色效果的影響Fig.3 Effect of concentration of chromogenic agent on chromogenic reaction

2.2.1.3 反應(yīng)時間對顯色效果的影響 由圖4可知，反應(yīng)時間過短,顯色不充分;反應(yīng)時間過長,延長了檢測時間,不利于快速檢測需要。當(dāng)顯色反應(yīng)10 min后,反應(yīng)完全,吸光值達到最大值,且在實驗時間內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖4 反應(yīng)時間對顯色效果的影響Fig.4 Effect of time on chromogenic reaction

2.2.2 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以鹽酸濃度、顯色劑濃度、反應(yīng)時間為考察因素。進行L9(33)正交實驗。正交實驗直觀分析表見表2,方差分析表見表3。由極差分析結(jié)果可知,對顯色效果影響的主次順序為:B>A>C,即顯色劑濃度>鹽酸濃度>反應(yīng)時間。由方差分析表可知,顯色劑濃度對方法靈敏度影響顯著,鹽酸濃度、反應(yīng)時間對靈敏度影響不顯著。由k值大小可知,優(yōu)化工作條件組合為A2B2C2,此結(jié)果與單因素實驗篩選出的最佳條件組合一致。此組合在表2中未出現(xiàn),正交實驗均值最高組合為A2B2C3,比較兩組合差異在于反應(yīng)時間。由于反應(yīng)時間對靈敏度影響不顯著,為節(jié)約檢測時間,確定最佳工作條件組合為A2B2C2,即鹽酸濃度為0.4 mol/L,間苯二胺顯色劑濃度為30 g/L,反應(yīng)時間為10 min。進一步重復(fù)實驗表明,該工作條件下,反應(yīng)穩(wěn)定性良好，A451 nm為2.5462。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交實驗方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在最佳工作條件下,吸取一系列濃度梯度的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進行顯色反應(yīng),在451 nm處測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖5。線性范圍為0～5 mg/L。

圖5 亞硝酸鈉測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curvefor nitrite determination

2.4 共存離子干擾實驗

2.5 檢出限

國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)規(guī)定,檢出限是一個分析方法能夠可靠地檢測出被分析物的最低濃度[20]。吸取20份空白水樣,進行測定。計算得檢出限為0.017 mg/L。

2.6 空白添加回收實驗

添加回收率常用來評價一個分析方法的準(zhǔn)確度[21]。分別以0.5、1.0、1.5倍允許限量,即0.05、0.10、0.15 mg/L三個濃度水平進行添加,添加量在方法的線性范圍內(nèi)。澄清水樣可直接取樣檢測。測定結(jié)果見表4?？梢钥闯?空白加標(biāo)回收率在95.24%～103.98%之間,變異系數(shù)<5%。說明,本研究所建立的亞硝酸鈉微孔板法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 空白加標(biāo)回收率測定Table 4 Recoveries of nitrite from spiked samples

3 結(jié)論

本研究基于亞硝酸鹽可與間苯二胺在強酸性條件下發(fā)生重氮化偶聯(lián)反應(yīng),生成橙紅色偶聯(lián)產(chǎn)物環(huán)偶氮亞氨基苯的原理,建立了一種微孔板法,可用于飲用水等食品中亞硝酸鹽殘留量的高通量定量測定。該微孔板法以間苯二胺為顯色劑,最佳測定波長為451 nm;最佳工作條件為鹽酸濃度為0.4 mol/L、間苯二胺濃度為30 g/L、反應(yīng)時間為10 min;檢出限為0.017 mg/L,線性范圍為0～5 mg/L。該微孔板法具有快速、靈敏,可實現(xiàn)高通量檢測等優(yōu)點,可用于飲用水等食品中亞硝酸鹽殘留量的現(xiàn)場快速高通量檢測,可進一步開發(fā)為商品化試劑盒,具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。

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