王 鼎， 余 淼， 付洋洋， 郭春華*， 彭忠利， 高彥華

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都611130）

蛋白酶存在于動物、植物、微生物中，屬于水解酶類，約占世界酶制劑銷量的60%（馬俊陽等，2014）。在分子生物學(xué)和微生物發(fā)酵技術(shù)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上，微生物蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用越來越普遍，雖然很多微生物蛋白酶被大量用于飼料工業(yè)和畜牧生產(chǎn)，但是大量的研究都集中在單胃動物的生產(chǎn)性能方面（李東東等，2015），而反芻動物方面的研究較少。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，反芻動物瘤胃中含有10種以上的瘤胃真菌，能產(chǎn)生蛋白酶的共有6種，并且6種均具有氨基酸活性的內(nèi)切酶?？梢姡雌c動物瘤胃內(nèi)的真菌在開發(fā)新型蛋白飼料、提高動物飼料利用率、降低飼料成本上具有巨大潛力。

本研究旨在從肉牛瘤胃液中分離出產(chǎn)蛋白酶的霉菌，篩選出產(chǎn)蛋白酶活性較高的菌株，對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，為此菌株更好的應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株及培養(yǎng)基 菌株來源：從成都市青白江唐家寺肉牛屠宰場的肉牛瘤胃中采集瘤胃液，四層紗布過濾后帶回實驗室備用。選擇性培養(yǎng)基：淀粉8 g，葡萄糖15 g，酵母提取物1 g，蛋白胨6 g，KH2PO43g，MgSO40.5g，瓊脂 15g，蒸餾水 1000mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩與水以質(zhì)量比1∶1配制而成，自然pH。

酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白15 g，Na2HPO42 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g。

查氏培養(yǎng)基： 蔗糖 30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15 g，定容至 1000 mL，pH 6.0 ～ 6.5。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂糖 10 g，定容至 1000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻后加AMP 1 μL/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂糖 10 g，定容至 1000 mL，115 ℃滅菌 20 min，冷卻至 60 ℃左右，加 AMP 1 μL/mL、IPTG 1 μL/mL、X-gal 2 μL/mL， 倒平板后 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2產(chǎn)蛋白酶菌的分離純化 用滅菌生理鹽水將瘤胃液梯度稀釋，取 10-3、10-5、10-6梯度的稀釋液100 μL涂布選擇性初篩平板，30℃倒置培養(yǎng)36 h后挑取單菌落劃線培養(yǎng)。將劃線培養(yǎng)后的菌株點種于酪蛋白培養(yǎng)基平板，30℃倒置培養(yǎng)48 h，測定產(chǎn)生水解透明圈的菌落HE值（HE值=透明圈直徑/菌落直徑）后4℃保存?zhèn)溆?。吸? mL產(chǎn)生透明圈的菌株孢子懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，30℃培養(yǎng)72 h后測定蛋白酶活力。

1.3產(chǎn)蛋白霉菌的鑒定 綜合HE值和酶活性兩個指標(biāo)，選出蛋白酶活性最高的一株進行形態(tài)鑒定、分子鑒定。

1.3.1形態(tài)鑒定 形態(tài)鑒定主要通過 《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》的描寫，再根據(jù)菌株生長情況對其進行判斷。

1.3.2分子鑒定 將產(chǎn)蛋白酶菌在30℃、150 r/min的條件下進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng) 3 d后的菌絲體5000 r/min離心5 min。無菌水沖洗2～3遍后，用濾紙吸干水放入液氮中快速冷凍。將凍好的菌體放入研缽中研磨至很細的粉末狀，放入離心管中備用。依據(jù)天根柱式真菌試劑盒說明書提取菌株DNA基因組。

以菌株DNA基因組為模版，擴增菌株的18S rDNA基因片段。所用引物為P1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC -3' 和 P2：5' -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min；93℃變性 1 min；56℃退火 1 min；73℃延伸2 min，共30個循環(huán)；70℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。按照AxyPrep DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段，然后將其連接至PMD-19T載體，AMP+挑選陽性菌落，后交送上海英濰捷基公司測序。

1.4單因素試驗 選擇接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間作為影響蛋白酶活性的主要因素，通過單因素試驗選取響應(yīng)面試驗的水平。

1.4.1不同接種量對蛋白酶活性的影響 將初始菌液按1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%的接種量接種，30℃培養(yǎng)48 h，測蛋白酶活力。

1.4.2不同培養(yǎng)溫度對蛋白酶活性的影響 以4%接種量接種，培養(yǎng)溫度分別為26、28、30、32、35、37℃，培養(yǎng)48 h，測蛋白酶活力。

1.4.3不同培養(yǎng)時間對蛋白酶活性的影響 以4%接種量接種，30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為24、36、48、54、60、72、76 h，測蛋白酶活力。

1.5響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度為自變量，以蛋白酶活性為響應(yīng)值，進行中心組合試驗設(shè)計（陳琳，2011）。每個試驗重復(fù)3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。

表1　試驗因素水平及編碼表

1.6數(shù)據(jù)處理 用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行初步整理，用Design Expert 7.0軟件進行響應(yīng)面分析，用SPSS18.0進行方差分析及差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)蛋白酶菌的分離純化 瘤胃稀釋液經(jīng)選擇性初篩平板30℃培養(yǎng)36 h后，共分離純化出34株菌，分別命名為A1～A34。其中產(chǎn)生酪蛋白水解圈的菌株共17株，測定HE值，如表2所示，其中菌株A18的HE值最大。

表2　產(chǎn)蛋白酶菌株初篩

將HE值較大的6株菌，發(fā)酵培養(yǎng)后測定其蛋白酶活性，如表3所示，綜合HE值和蛋白酶活性，選擇A18進行形態(tài)及分子鑒定。

2.2形態(tài)鑒定 將A18菌株涂布于平板中，進行形態(tài)觀察。該菌在查氏培養(yǎng)基上生長較快，培養(yǎng)24 h左右菌落直徑可達2～3 cm，菌落起初呈白色羊毛狀，有的略有放射狀溝紋，慢慢變黃繼而變成黃褐色或綠褐色孢子，菌株衰老后，顏色變暗，背面淡褐色，且有褶皺。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，此菌株菌絲相當(dāng)發(fā)達，不但有隔膜，而且菌絲頂端能直接產(chǎn)生孢子梗，并且分生孢子是串生的特征。根據(jù)《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》的描述，初步判定A18為米曲霉。

表3　菌株的復(fù)篩

2.3分子鑒定

2.3.118S rDNA PCR擴增 以A18菌株基因組DNA為模板，P1、P2為引物，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物大約1800 bp，為一條單帶。

圖1　18S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3.2序列分析 測序結(jié)果顯示，A18菌株18S rDNA全長1800 bp，在NCBI的Blast中進行比對，結(jié)果與GenBank中登陸的Aspergillusniger contig An03c0100，genomic contig（AM270052.1）、Aspergillusoryzae DNA for 18S rRNA，partial sequence （AM270051.1）、Aspergillusoryzae RIB40 DNA，SC206（AP007173.1）序列相似性均為 99%，確定A18為米曲霉。

2.4單因素試驗

2.4.1接種量對菌株A18產(chǎn)蛋白酶活性的影響由圖2可見，蛋白酶活性隨著接種量的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢，在4%時達到最大值，之后隨著接種量增加呈下降趨勢。因此，在接種量為4%時，蛋白酶活性最高。

圖2　接種量對菌株產(chǎn)蛋白酶活性的影響

2.4.2培養(yǎng)溫度對菌株A18產(chǎn)蛋白酶活性的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，蛋白酶活性增加，在30℃時活性達到最大。但繼續(xù)隨著溫度升高，蛋白酶活性逐漸降低。所以，在溫度為30℃時，酶活性最高。

圖3　培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)蛋白酶活性的影響

2.4.3培養(yǎng)時間對菌株A18產(chǎn)蛋白酶活性的影響由圖4可知，開始階段，酶活性很低且增長緩慢，36 h后蛋白酶活性隨時間的增加呈增大趨勢，且在60 h達到最大。60 h之后，蛋白酶活性急劇下降，所以，在培養(yǎng)時間為60 h時，酶活性達到最大。

圖4　培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)蛋白酶活性的影響

2.5響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.5.1回歸模型的建立及方差分析 采用中心組合試驗設(shè)計，方案及結(jié)果見表4。用Design Expert軟件對表中數(shù)據(jù)進行多元擬合，得到A18蛋白酶活力 Y 對接種量（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、培養(yǎng)時間（X3）的多項回歸方程為：Y1=372.34+49.17X1+102.58X2+ 91.06X3+34.75X1X2+44.61X1X3-

表4　響應(yīng)面試驗設(shè)計與試驗結(jié)果

對上述回歸模型進行方差分析，如表5所示，雖然X12系數(shù)不顯著，但是三因素交互差異極顯著，且該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9884，說明該回歸方程與實際情況擬合度良好，利用該方程來代替實際試驗點進行分析具有合理性。

表5　回歸模型方差分析

2.5.2兩因素對蛋白酶活性的響應(yīng)面分析 用Design Expert軟件對表4數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，所得到的兩因素交互的響應(yīng)面三維圖及等高線圖，如圖5～7所示。

圖5　接種量與溫度交互作用對蛋白酶活性影響的響應(yīng)面三維圖及等高線圖

從圖5可以看出，該響應(yīng)面存在最高點，說明在試驗所選擇的接種量與溫度范圍內(nèi)，存在使米曲霉A18蛋白酶活性達到最大的值，這個值就是該響應(yīng)面的最高點。在時間為48 h時，接種量與溫度對蛋白酶活的交互作用顯著，接種量為2.7%～4%，溫度為27～29℃時，蛋白酶活性較高。等高線圖為橢圓形，說明接種量與溫度對米曲霉A18產(chǎn)蛋白酶的交互作用明顯。

由圖6可以看出，在接種量為3%時，溫度與時間對蛋白酶活的交互作用顯著，溫度為27～29℃，時間為54～60 h時，蛋白酶活性較高。而且從圖中可以看出該響應(yīng)面存在最高點，說明在試驗所選擇的溫度與時間范圍內(nèi)存在一個使米曲霉A18蛋白酶活性達到最大的值，這個值即是此響應(yīng)面的最高點，也是等高線中最小橢圓的中心點。等高線圖為橢圓形，說明溫度與時間對米曲霉A18產(chǎn)蛋白酶的交互作用明顯。

從圖7可以看出，該響應(yīng)面存在最高點，說明在試驗所選擇的接種量與時間范圍內(nèi)，存在一個使米曲霉A18蛋白酶活性達到最大的值，這個值即是此響應(yīng)面的最高點，也是等高線中最小橢圓的中心點。在溫度為30℃時，接種量與時間對蛋白酶活的交互作用顯著，接種量為3%～4%，時間為54～60 h時，蛋白酶活性較高。等高線圖顯示為橢圓形，說明接種量與時間對米曲霉產(chǎn)蛋白酶的交互作用明顯。

2.5.3回歸模型的驗證 通過Design Expert 7.0得出米曲酶A18的最佳產(chǎn)酶條件為接種量3.67%、溫度28.57℃、培養(yǎng)時間54.59 h。在此條件下，菌株A18中性蛋白酶活力最大。為簡化試驗，在接種量4%、溫度29℃、時間55 h的條件下進行重復(fù)試驗，測定中性蛋白酶活性為527.57 U/mL。

3　討論

圖7　接種量與時間的交互作用對蛋白酶活性影響的響應(yīng)面三維圖及等高線圖

鑒定霉菌通常通過形態(tài)鑒定和生理生化分析（楊亞晉等，2013；宋鵬，2012），但此種方法往往只能判斷到微生物的屬水平，不能準(zhǔn)確地對微生物進行分類鑒定。通過分子生物學(xué)技術(shù)對微生物進行鑒定，能充分反映物種之間的同源性，鑒定到種水平。本文通過形態(tài)鑒定與分子鑒定相結(jié)合的方法，確定A18菌株為米曲霉。對于蛋白酶活性測定方法來說，先通過酪蛋白水解圈法進行產(chǎn)蛋白酶菌初篩，選出產(chǎn)蛋白霉菌共16株，測定其HE值，并以此作為菌株產(chǎn)蛋白霉菌能力的初步鑒定，但HE值不能作為蛋白酶活高低的準(zhǔn)確依據(jù)，所以本文挑選出HE值較大的6株菌，紫外分光光度法測定蛋白酶活，綜合HE值和蛋白酶活比較，選出酶活最高的A18菌株，酶活性為415.82 U/mL。這與徐建國（2010）（最高酶活 129.2 U/mL）、李曹龍（2012）（最高酶活41.653 U/mL）、 吳麗娜 （2017）（最高酶活49.21 U/mL）等研究相比，酶活要高出很多，這對將來此菌用于生產(chǎn)具有重大的意義。

合適的培養(yǎng)條件對微生物生長、繁殖、代謝有很大影響，試驗先通過單因素試驗研究接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間三個因素對菌株A18產(chǎn)蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明，接種量為4%，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為60 h時，A18的蛋白酶活性最高。接種量過低，菌株無法在培養(yǎng)時間內(nèi)產(chǎn)生足夠的孢子數(shù)；接種量過高，孢子大量繁殖，在培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)一定的情況下，菌株的生長受到抑制，這兩方面的因素都不利于蛋白酶的產(chǎn)生和積累，導(dǎo)致蛋白酶活性降低。溫度也是產(chǎn)酶條件的重要影響因素之一。隨著溫度的升高，蛋白酶活性增加，到30℃時活性達到最大；再繼續(xù)增加溫度，蛋白酶活性開始降低。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是溫度過高會導(dǎo)致酶的失活，從而影響酶活性的大小。培養(yǎng)時間的長短影響著微生物的生長，培養(yǎng)時間過短，微生物生長緩慢，酶的合成較少；反之，由于培養(yǎng)時間過長，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及代謝產(chǎn)物的積累都會影響微生物的生長。

單因素試驗結(jié)果并不能直接準(zhǔn)確得出最佳產(chǎn)酶條件，所以本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化試驗。采用該試驗方案測定數(shù)據(jù)，得到回歸方程，對此回歸模型進行方差分析，利用所得回歸方程進行預(yù)測，如表5所示，回歸模型與實際情況擬合較好。Design Expert設(shè)計響應(yīng)面三維圖顯示，在溫度一定的情況下，隨著接種量的增加，蛋白酶活性提高，但到達極值時，又有下降的趨勢；在接種量為固定值時，蛋白酶活隨溫度升高而增加，到達極值，呈下降趨勢，說明二者對蛋白酶活性提高是有交互作用，當(dāng)接種量在最高水平附近、溫度在中間值附近時，可以提高蛋白酶活性。

4　結(jié)論

本試驗從肉牛瘤胃液中初篩選出34株菌，其中A18菌株蛋白酶活達415.82 U/mL。通過A18菌株18S rDNA序列比較，結(jié)合形態(tài)特征，確定其為米曲霉。經(jīng)連續(xù)多次重復(fù)優(yōu)化試驗，確定最佳產(chǎn)酶條件為接種量4%、培養(yǎng)溫度29℃、培養(yǎng)時間55 h，其最高酶活可達527.57 U/mL，比優(yōu)化之前提高了22.6%。

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