王昭昕，李淑琴，王培順，王巖，高希濤

(連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇連云港 222002)

乳腺癌全球每年新發(fā)病例約170萬，約占女性惡性腫瘤的25%，死亡病例約50萬，約占女性腫瘤相關(guān)死亡的15%[1]。近年來，以手術(shù)為基礎(chǔ)并輔以放化療、靶向治療的綜合治療方案，取得較大進(jìn)展，但乳腺癌患者的預(yù)后仍不樂觀，術(shù)后復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者不良預(yù)后甚至死亡的重要原因[2]，臨床亟需尋找新的有效生物分子靶標(biāo)[3,4]。大鼠肉瘤蛋白活化因子2(RASAL2)是一種Ras GTP酶活性蛋白(GAP)，由RASAL2基因編碼，定位于人染色體1q25。RASAL2是RAS基因的一個重要活性蛋白，近年研究[5]表明，RASAL2具有潛在的腫瘤抑制功能，在卵巢癌[6]、肺癌[7]及星形細(xì)胞瘤[8]等多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。而關(guān)于RASAL2在乳腺癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系，目前國內(nèi)外研究較少。2010年1月～2017年6月,我們采用免疫組化SP法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中RASAL2表達(dá)，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取我院2010年1月～2012年1月乳腺癌患者70例。納入標(biāo)準(zhǔn)：完整的病例治療；術(shù)前未進(jìn)行雌激素及放化療的治療；術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理證實為浸潤性乳腺癌；所有患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎疾病，免疫系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重的心腦血管疾病及感染性疾病?；颊吣挲g:<45歲28例，≥45歲42例；絕經(jīng)前21例，絕經(jīng)后49例；腫瘤直徑：≤3 cm 34例，>3 cm 36例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；存在脈管侵襲41例，無脈管侵襲29例；組織學(xué)分級：I+Ⅱ級31例，Ⅲ級39例；TNM分期，I+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期45例；三陰乳腺癌22例，非三陰乳腺癌48例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。采用電話或者門診的方式進(jìn)行隨訪，隨訪時間為手術(shù)后6～60個月。

1.2乳腺癌組織及癌旁組織中RASAL2表達(dá)檢測采用免疫組化SP法。取手術(shù)切除的乳腺癌組織及其癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥1 cm)，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片；切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌，微波修復(fù)抗原，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，滴加RASAL2一抗工作液(美國Santa公司，稀釋比1∶150)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加生物素二抗(北京普博斯生物科技有限公司，稀釋比1∶200)，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。RASAL2蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，顯微鏡(CK30-F200，日本Olympus公司)下觀察，對細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無著色為0分。顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞，隨機(jī)觀察10個高倍鏡視野，平均每個高倍鏡視野的陽性細(xì)胞數(shù)：無著色為0分，1～25%為1分，26～50%為2分，51～75%為3分，>75%為4分。最后得分為兩項乘積(0～12)，≥5判定為陽性表達(dá)。

2　結(jié)果

2.1RASAL2在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)比較乳腺癌及癌旁組織中RASAL2的陽性表達(dá)率分別為32.86%(23/70)、88.57%(62/70)，二者比較，P<0.05。

2.2RASAL2表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌組織中，RASAL2表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、組織學(xué)分級無關(guān)(P均>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵襲、TNM 分期、三陰乳腺癌有關(guān)(P均<0.05)，見表1。

2.3RASAL2表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系本研究中70例乳腺癌患者，術(shù)后獲隨訪6～60個月，其中死亡8例。將患者分為RASAL2陰性表達(dá)組(47例)與RASAL2陽性表達(dá)組(23例)，繪制的Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，RASAL2陰性表達(dá)組的術(shù)后5年生存率為85.11%(40/47)，生存時間為6～60(53.28±2.09)個月，而RASAL2陽性表達(dá)組的術(shù)后5年生存率為95.65%(22/23)，生存時間為12～60(59.74±0.26)個月。Log-Rank檢驗結(jié)果顯示，RASAL2陽性表達(dá)者生存時間較陰性表達(dá)者延長(χ2=7.037，P=0.008)。

3　 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，根據(jù)其基因表達(dá)不同，可分為五種分子亞型，包括Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達(dá)型、Basal型(即三陰性型)和Normal型，不同分子亞型之間，其腫瘤生物學(xué)行為、生長速度、特定信號通路活性及腫瘤細(xì)胞組成方面存在顯著差異[9]。

在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，存在RAS信號通路的異常激活[10]，有研究證實，RAS上游誘導(dǎo)因子或下游效應(yīng)因子發(fā)生基因突變是RAS信號通路異常激活的主要機(jī)制[10, 11]。RAS的GTP酶是RAS信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，RAS與鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)和GAP共同組成RAS信號通路的開關(guān)。GEF激活GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP，激活RAS信號通路，而GAPs則促進(jìn)GTP水解為GDP，終止激活作用[12]。RASAL2屬于GAP家族，在腫瘤形成和侵襲過程中發(fā)揮作用，如甲狀腺癌[13]等。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RASAL2在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示RASAL2在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因功能，其表達(dá)缺失促進(jìn)了乳腺癌的腫瘤形成。

表1　　　　RASAL2表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理

本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵襲及TNM分期高的乳腺癌組織中RASAL2陽性表達(dá)率低，且Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明，RASAL2陽性表達(dá)率低的乳腺癌患者術(shù)后5年總生存率和平均生存時間均較低，以上結(jié)果提示RASAL2低表達(dá)與乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲和不良預(yù)后密切相關(guān)，與McLaughlin等[5]的研究結(jié)果一致。

最近研究證實，在三陰乳腺癌和雌激素受體(ER)陰性乳腺癌中，具有抗遷移能力的microRNA-203表達(dá)降低，而RASAL2作為microRNA-203的靶基因，其表達(dá)則顯著增加，且高表達(dá)RASAL2是乳腺癌不良預(yù)后的潛在靶標(biāo)[15]。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，在三陰乳腺癌組織中，RASAL2的陽性表達(dá)率顯著高于非三陰乳腺癌，與上述研究結(jié)果一致，提示RASAL2在三陰乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因功能。

綜上所述，RASAL2在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)低于癌旁組織，且其低表達(dá)與乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵襲和腫瘤TNM分期密切相關(guān)，提示RASAL2是乳腺癌腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展中一個重要調(diào)節(jié)因子。

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