喬 菊,代啟虎,李 冉,梁田田,盧 瑛,李柏林,歐 杰

上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,分子生物學(xué)實驗室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海),上海 201306

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種毒性非常強的海洋生物活性物質(zhì)，它是典型的神經(jīng)N a+通道阻斷劑。最初主要是從豚科魚(Tetrodontidae)中被發(fā)現(xiàn)，被Tahara(1909)命名為Tetrodotoxin。

TTX是世界上最致命的生物毒素之一[1]，毒性是氰化鈉的1250倍，0.5 mg就可以致人于死命[2]。TTX中毒之后，它的潛伏期短、同時病死率很高，吸收后會損壞中樞神經(jīng)和末梢神經(jīng)系統(tǒng)，使神經(jīng)傳導(dǎo)出現(xiàn)障礙，先會感到神經(jīng)麻痹，后是運動神經(jīng)麻痹，嚴(yán)重的腦干麻痹則會導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭[3]。TTX主要分布在河豚的卵巢、腎臟、肝臟、血液、眼睛、魚鰓還有皮膚內(nèi)，尤是以卵巢和肝臟中含量較多[4]。TTX及其類似物不僅分布于河豚魚體內(nèi)，另外還存在于多種脊椎及無脊椎動物體內(nèi)，例如兩棲動物、棘皮動物、節(jié)肢動物、軟體動物等[5]。TTX的理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，在中性和酸性溶液中穩(wěn)定，在堿性水溶液中比較容易被分解，降解為幾種喹啉化合物[6]。TTX一般難以通過烹調(diào)手段來破壞，中毒后也沒有有效的解救措施[7]。

在白酒釀造過程中，酒醅是指加酒曲后發(fā)酵好的糧食。這類糧食發(fā)酵過程中，會有大量的微生物繁殖生長，其中的微生物主要有酵母、霉菌和細(xì)菌。在日本的石川縣，用河豚卵巢做的米糠浸漬醬菜，是用鹽腌藏河豚卵巢，然后放入到米糠中讓其發(fā)酵，鹽漬一段時間之后，

河豚卵巢的毒性可降低到一個可食用的范圍[8]。這可能是米糠中的某些微生物有降解TTX毒性的作用。方國鋒等用EDC/NHS化學(xué)偶聯(lián)法將磁性納米微球與TTX單克隆抗體（實驗室自備）[9]進(jìn)行偶聯(lián)，制備了磁性免疫探針，又參考徐曉巍等的方法[10]制成了免疫層析試紙條。本研究采用此試紙

1 材料與方法

條為測量方法，利用酒醅中的微生物種群來降解河豚毒素。

1.1 儀器，試劑及材料

純度大于99%的TTX標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；超濾離心管購自上海蒙昌儀器有限公司；酒醅為山西杏花春汾酒集團(tuán)有限責(zé)任公司提供；實驗動物為SPF級別昆明鼠，雄性，19～21 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZWY-2102C Incubator Shaker購自上海智誠分析儀器制造有限公司；Eppendorf離心機5810B型購自德國Eppendorf公司；MAR磁信號分析系統(tǒng)購自美國Magna Bio Sciences公司。

1.2 樣品前處理

TTX經(jīng)酒醅發(fā)酵降解后，在5000 r/min的條件下離心15 min，取上清液；上清液在10000 r/min的條件下離心15 min，取上清；上清液調(diào)節(jié)pH至中性（試紙條在中性環(huán)境下檢測才準(zhǔn)確，所以檢測之前要對樣品進(jìn)行調(diào)節(jié)pH至中性的操作），取4 mL配平pH的上清液加入到超濾離心管中，在4000 r/min條件下離心20 min。取經(jīng)超濾的樣品液按比例加入層析液和磁珠，滴加到試紙條上，30 min之后用磁信號儀進(jìn)行磁信號值的測定。

1.3 實驗方法

免疫層析檢測采用的是間接競爭模式，對于陽性樣本，C線區(qū)域有明顯的顏色反應(yīng)；陰性則T線顯色，本實驗所使用試紙條是基于相同原理制成的。即是說河豚毒素的毒性越大，則試紙條C線顯色越深，所測C線的磁信號值越大；反之，隨著河豚毒素被降解，試紙條T線顯色越深，所測到的T線的磁信號值就會越大。另外，試紙條測河豚毒素時最大檢測上限為5μg/mL，所以本實驗中TTX的初始濃度都定為5μg/mL。以TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的試紙條T線的磁信號值為縱坐標(biāo)建立對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此判斷磁性免疫層析法是否適用于TTX的定量分析和檢測。結(jié)果處，以各影響因素為橫坐標(biāo)，樣品檢測試紙條上T線信號值為縱坐標(biāo)來做圖。TTX的降解率={（樣品試紙條T線磁信號值-5μg/mL TTX標(biāo)準(zhǔn)品試紙條T線磁信號值）/(陰性對照磷酸緩沖液（PBS）試紙條T線磁信號值-5μg/mL TTX標(biāo)準(zhǔn)品試紙條T線磁信號值)}×100%。

1.4 降解條件優(yōu)化

1.4.1 酒醅添加量對降解效果的影響 秤取4、8、12、16、20 g酒醅，分別對應(yīng)加入3、7、11、15、19 mL滅過菌的去離子水，然后再對應(yīng)加入1 mL的20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)品溶液。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，放置到恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，溫度設(shè)為30℃。72 h后，經(jīng)前處理后測磁信號值。

1.4.2 溫度對降解效果的影響 酒醅中加入TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌均勻后，分別放置在條件為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的無水恒溫培養(yǎng)箱中。反應(yīng)72 h后，取出，經(jīng)前處理后測磁信號值。

1.4.3 搖床轉(zhuǎn)速對降解效果的影響 參照賈晉斌等[11]研究酒曲發(fā)酵液降解河豚毒素時搖床轉(zhuǎn)速的設(shè)定，本實驗在酒醅中加入河豚毒素之后，攪拌均勻，分別放置在條件為20 r/min、50 r/min、80 r/min、100 r/min、150 r/min的搖床中30℃反應(yīng)，72 h后，取出，經(jīng)前處理后測磁信號值。

1.4.4 時間對降解效果的影響 TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到酒醅中后，用上面確定的最佳降解條件進(jìn)行培養(yǎng)。每隔一天取出一個樣品，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)錅y。7 d后對7個樣品經(jīng)前處理后，測磁信號值。主要為了計算最佳條件下酒醅對TTX的降解率會達(dá)到多少。

1.4.5 小鼠生物法檢測降解效果 將上述降解1～7 d的TTX樣品，用小鼠法[12-14]來檢測酒醅對TTX的降解效果。每只小鼠的注射劑量為1 mL，每個樣品注射3只體重相差不大的小鼠，取3只小鼠的死亡時間的平均數(shù)作為該樣品的致死時間。當(dāng)注射器把樣品全部注入小鼠腹腔內(nèi)時開始計時，以出現(xiàn)了河豚毒素中毒的典型癥狀為標(biāo)準(zhǔn)判斷小鼠是否中毒，當(dāng)小鼠停止呼吸時便停止計時。小鼠中毒的癥狀是開始先安靜，之后躁動轉(zhuǎn)圈、動作不靈活、呼吸困難、身體抽搐，最終死亡。

1.5 統(tǒng)計分析

文中的試紙條結(jié)果都是5次平行試驗的平均值，小鼠則是3次平行試驗的平均值。用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。其中同列肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P≤0.05），肩標(biāo)相同字母則表示無顯著差異（P＞0.05）。

2 結(jié)果

2.1 免疫層析定量檢測

對不同濃度TTX標(biāo)準(zhǔn)品試紙條的T線部分的磁信號進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。TTX的含量在100～5000 ng/mL的范圍內(nèi)，與磁信號的值具有良好的線性關(guān)系，關(guān)系式y(tǒng)=-0.1303x+813.88，R2為0.9944。由此可見，磁性免疫層析方法可用于TTX的定量分析和檢測。

圖1 河豚毒素免疫層析法檢測定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of immunochromatography for TTX

2.2 降解條件的優(yōu)化

2.2.1 酒醅添加量對降解效果的影響 SPSS軟件的統(tǒng)計分析結(jié)果（表1）顯示隨著酒醅添加量的增多，試紙條的T線磁信號值在不斷增大，說明河豚毒素在不斷被降解，毒性越來越低。酒醅添加量到達(dá)16 g之前，試紙條上T線磁信號值之間變化顯著（P≤0.05）。這可能是因為，隨著酒醅量的增加，微生物的數(shù)量也在增加，因而與河豚毒素的作用加強。而當(dāng)酒醅添加量為16 g、20 g時，試紙條T線磁信號值之間沒明顯差異（P＞0.05）。這可能是當(dāng)微生物數(shù)量繼續(xù)增加時，由于受到包括溶氧量等其他條件的限制，化合物降解不再發(fā)生變化。所以最優(yōu)酒醅添加量為16 g。

表1 不同酒醅添加量對TTX降解的影響結(jié)果的顯著性分析Table 1 Notability analysis on influence of different fermented grains dosage to TTX degradation

2.2.2 溫度對降解效果的影響 如圖2，當(dāng)溫度達(dá)到30℃時，試紙條T線磁信號值最大，說明此時河豚毒素的毒性最低。根據(jù)方法中降解率的計算公式，得出此溫度下河豚毒素的降解率達(dá)到43.6%。30℃之前，T線磁信號值隨溫度增加而增加，30℃之后，TTX線磁信號值不斷下降。溫度對微生物的生長有很大的影響，在最適生長溫度范圍之內(nèi)，隨著溫度的升高，反應(yīng)作用會不斷加強，但超過限定范圍時，一些活性物質(zhì)如酶會失活，從而影響反應(yīng)的結(jié)果。所以30℃為最佳降解溫度。

圖2 不同溫度對酒醅降解TTX的影響Fig.2 Influence of different temperatures on TTX degradation rate

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對降解效果的影響 由圖3可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為50 r/min時，試紙條T線磁信號值最大，說明此時酒醅對TTX的降解能力最佳，根據(jù)降解公式算出降解率可達(dá)53.8%。酒醅是半固體，搖床振蕩影響通氣量，通氣量不同則發(fā)酵結(jié)果不同。不同搖床轉(zhuǎn)速對TTX降解結(jié)果顯示通氣量確實對TTX的降解起到促進(jìn)作用。

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對酒醅降解TTX的影響Fig.3 Influence of different shaker rotate speeds on TTX degradation rate

2.2.4 時間對降解效率的影響 觀察表2統(tǒng)計分析結(jié)果，5 d以前，試紙條T線磁信號值之間變化顯著（P≤0.05），但當(dāng)降解達(dá)到第5、6、7 d時，試紙條T線磁信號值之間無顯著差異（P＞0.05）。根據(jù)降解率計算公式算出第5 d時的降解率達(dá)68.3%?？赡苁窃谶m宜的條件下培養(yǎng)時，隨著時間的延長，酒醅中微生物的數(shù)量在不斷增加，對河豚毒素的降解作用也在增強。而當(dāng)降解達(dá)到第5、6、7 d時，酒醅中降解河豚毒素的活性物質(zhì)不再發(fā)生變化，導(dǎo)致降解率不變。因此實驗時，5 d就可以進(jìn)行1次數(shù)據(jù)測定。

表2 時間酒醅降解TTX的影響結(jié)果的顯著性分析Table 2 Notability analysis on influence of time to TTX degradation

2.2.5 小鼠生物法檢測結(jié)果 觀察表3的顯著性分析表格，在降解5 d之前，小鼠的死亡時間之間變化顯著（P≤0.05），5 d之后小鼠的死亡時間變化不顯著（P＞0.05）。這準(zhǔn)確驗證了酒醅降解TTX的時間規(guī)律。雖然不能達(dá)到完全解毒的效果，但證明了酒醅確實有降解TTX的能力。酒醅降解7 d后，腹腔注射TTX的小鼠的死亡時間為17′29″，依據(jù)國標(biāo)法[13]附錄A中表A，查出此時的TTX的毒力為1.26 MU。5μg/mL的TTX腹腔注射小鼠時，小鼠的死亡時間為1′23″，小于4 min，查出毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于6.13 MU。毒力降低值大于4.87 MU。

表3 小鼠生物法檢測酒醅對TTX的降解效果的顯著性分析Table 3 Significant analysis on the degradation effect of fermented grains on TTX by mouse bioassay

3 討論

本實驗研究了酒醅降解河豚毒素的最優(yōu)條件，結(jié)果表明在酒醅添加量為16 g，溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為50 r/min的條件下，酒醅對河豚毒素的降解能力最強，用小鼠生物法來驗證時間對降解效果的影響時，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，小鼠的死亡時間在延長，第五天之后趨于不變，驗證了酒醅降解河豚毒素的時間規(guī)律，同時也證明了酒醅對河豚毒素確實有降解作用，其中有可能是酒醅中的微生物在起降解作用。賈晉斌，舒靜[11]等研究酒曲對河豚毒素的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn)酒曲發(fā)酵液對河豚毒素的降解具有較為顯著的效果，結(jié)果表明在溫度為30～35℃，搖床轉(zhuǎn)速為50 r/min的條件下，酒曲對河豚毒素的降解能力最佳。TTX含有苯吡啶結(jié)構(gòu)，而微生物在好氧和厭氧環(huán)境下都可以利用吡啶及其衍生物[15]。TTX也是一種氨基全氫化喹唑啉化合物，能夠降解喹啉及其衍生物的菌株也被大量分離鑒定出來，如假單胞菌屬（Pseudomonassp.）[16]可降解喹啉，黃單孢菌屬（Xanthomonas）[17]可降解4-甲基喹啉。

關(guān)于TTX的降解機理以及TTX被轉(zhuǎn)化為何種物質(zhì)，這需要進(jìn)一步的研究，現(xiàn)在還沒有確定的研究結(jié)果。汾酒屬于清香型白酒，李增勝、任潤斌[18]研究了清香型白酒在發(fā)酵過程中的主要微生物，認(rèn)為酵母菌類中主要有擬內(nèi)孢霉、酵母菌屬、假絲酵母和異常漢遜酵母；霉菌類中主有根霉、紅曲霉、梨頭霉、毛霉和黃米曲霉；細(xì)菌類中主要有革蘭氏陰性芽孢細(xì)菌、乳酸菌和醋酸菌。介于微生物在毒素降解中的作用，所以酒醅能夠降解TTX可能是是酒醅中的微生物對河豚毒素起了生物轉(zhuǎn)化的作用。微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)（底物）轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)（產(chǎn)物）的過程，是通過微生物細(xì)胞將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物代謝過程產(chǎn)生的某個或某一系列的酶之間的相互作用對底物特定基團(tuán)進(jìn)行的催化反應(yīng)[19]。也許可以根據(jù)酒醅中的菌相來建立一個微生物體系，通過不斷調(diào)試加入微生物的比例，不斷優(yōu)化，可以達(dá)到降解河豚毒素的作用。這對找出TTX的降解機理是個機會，可以作為一個研究的方向。

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