張愛(ài)君，杜瑾，張曉青，姜天翔，王樹(shù)勛，曹軍瑞

國(guó)家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192

S-腺苷-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）被稱(chēng)為“活性甲硫氨酸”，是一種廣泛存在于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)的重要中間代謝物質(zhì)[1-2]。同時(shí)，作為一種重要的生理活性物質(zhì)存在于人體內(nèi)，主要具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫基的作用，是人體內(nèi)100 多種甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的甲基供體，是谷胱甘肽和多胺的合成前體，充足的SAM是維持這些代謝途徑正常運(yùn)轉(zhuǎn)的前提。SAM 的臨床應(yīng)用極為廣泛，較常見(jiàn)的是用于治療肝病、骨關(guān)節(jié)炎、抗抑郁等常見(jiàn)疾病[3-5]。隨著市場(chǎng)需求日益增加，亟待開(kāi)發(fā)高效、環(huán)保的SAM 規(guī)?；苽涔に?。SAM 的制備方法主要有化學(xué)合成法、酶促合成法、發(fā)酵法。其中，微生物發(fā)酵技術(shù)制備SAM 具有成本低廉、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是目前SAM 工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法[6]。在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)添加L-甲硫氨酸，與細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）催化合成高濃度的SAM。常用的生產(chǎn)菌株為釀酒酵母[7]、畢赤酵母[8]等。

酵母發(fā)酵法生產(chǎn)SAM 雖然產(chǎn)量較高，但由于SAM 是胞內(nèi)產(chǎn)物，在分離純化過(guò)程中首先要破碎較厚的酵母細(xì)胞壁。有研究者試圖通過(guò)基因工程手段改造大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌等易破壁的微生物合成SAM[9-10]，但產(chǎn)量均顯著低于酵母菌，因此酵母菌仍是生產(chǎn)SAM 的最主要菌株。目前文獻(xiàn)報(bào)道破碎酵母釋放SAM 的方法主要有擠壓式細(xì)胞破碎法、超聲波法、液氮研磨法、反復(fù)凍融法和化學(xué)試劑法等，其中應(yīng)用較多的是化學(xué)試劑法。應(yīng)用最廣的提取劑是高氯酸和乙酸乙酯-硫酸[11-12]。高氯酸法的提取效果近乎100%，是早期提取SAM 的主要方法，但由于高氯酸的危險(xiǎn)性較高，目前僅用于提取標(biāo)準(zhǔn)[13]。乙酸乙酯-硫酸法的提取率可達(dá)90%，但有機(jī)溶劑用量大，提取成本和污染性均較高。因此，開(kāi)發(fā)提取酵母細(xì)胞內(nèi)SAM 的新工藝是非常必要的。

在此，我們從6 種不同提取劑中篩選出能夠高效提取酵母細(xì)胞胞內(nèi)SAM 的提取劑，并通過(guò)比較提取劑濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等因素對(duì)SAM 回收量的影響，確定了最佳提取條件，建立了一種胞內(nèi)SAM 提取的新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

SAM 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma 公司；超高效液相色譜（UPLC）所需試劑甲醇和甲酸銨為色譜純；濃硫酸、鹽酸、甲酸、高氯酸、磷酸、氯化鈉等試劑為分析純。

超高效液相色譜儀為Waters ACQUITY 型；pH 計(jì)為ORION 3 STAR 型；千分之一天平為梅特勒ME104E 型；恒溫振蕩器為上海智城ZHWY-2102C 型。

種子培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，115℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸鹽緩沖液0.1 mol/L（pH7.0），YNP 13.4 g/L，生物素4×10-5g/L，甘油20 g/L，L-蛋氨酸50 mmol/L，115℃滅菌20 min（L-蛋氨酸須過(guò)濾除菌）。

1.2 含SAM菌體的制備

挑取釀酒酵母菌于種子培養(yǎng)基，28℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h；按10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)120 h 后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min 離心15 min，去除上清液，用無(wú)菌水沖洗3 次，去除培養(yǎng)基殘留液，收集含SAM 的釀酒酵母細(xì)胞。

1.3 不同提取劑對(duì)SAM提取率的影響

取1 g 釀酒酵母濕細(xì)胞，選用6 種提取劑（高氯酸、甲酸、鹽酸、硫酸、硫酸+20% 氯化鈉、磷酸），提取劑濃度均為1.5 mol/L，用量為6 mL，常溫振蕩處理90 min 后，于4℃、10 000 r/min 離心15 min，取上清液作為分析樣品，測(cè)定不同提取劑處理后SAM 的提取率。

1.4 甲酸濃度和料液比對(duì)SAM回收量的影響

稱(chēng)取1 g 釀酒酵母濕細(xì)胞，加入甲酸溶液提取，分別采用不同提取劑濃度（0.4、0.8、1.2、1.6 mol/L）和不同料液比（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7 g/mL），常溫振蕩處理90 min 后，于4℃、10 000 r/min 離心15 min，取上清液作為分析樣品，測(cè)定甲酸不同濃度和料液比下SAM 的回收量。

1.5 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)SAM回收量影響的實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取1 g 釀酒酵母濕細(xì)胞，加入濃度為1.2 mol/L 的甲酸溶液25 mL，料液比為1∶5 g/mL，分別在不同提取溫度（15、20、25、30℃）下，振蕩處理不同時(shí)間（1、2、3、4 h），于4℃、10 000 r/min 離心15 min，取上清液作為分析樣品，測(cè)定不同提取溫度和提取時(shí)間下SAM 的回收量。

1.6 SAM濃度測(cè)定

采用超高效液相色譜法測(cè)定SAM 的濃度，色譜柱為C18反向柱（ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm），流動(dòng)相為0.01 mol/L 甲酸銨∶甲醇（98∶2），pH3.5～4.0，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，PDA 檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。SAM 標(biāo)準(zhǔn)品及分析樣品經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.7 SAM提取率、回收量計(jì)算

按下式計(jì)算SAM 提取率（q）、回收量（R）：

式中，q為SAM 的提取率（%），c1為從細(xì)胞內(nèi)提取的SAM 的濃度（mg/L），c0為高氯酸作為提取劑從細(xì)胞內(nèi)提取的SAM 的濃度（mg/L），R為回收量（mg/g），v1為提取劑用量（L），m1為細(xì)胞濕重（g）。

2 結(jié)果

2.1 提取劑的篩選

選用1.5 mol/L 的高氯酸、甲酸、鹽酸、硫酸、硫酸+20%氯化鈉、磷酸作為提取劑，分別加入事先裝有1 g 濕重酵母細(xì)胞的試管中，提取率結(jié)果見(jiàn)圖1。以1.5 mol/L 高氯酸為提取劑振蕩提取90 min 后胞內(nèi)SAM 的提取率為100%。以1.5 mol/L 的甲酸、鹽酸、硫酸、硫酸+20%氯化鈉、磷酸作為提取劑時(shí)，在相同操作條件下，磷酸的提取效果較差，低于10%；鹽酸、硫酸、硫酸+氯化鈉的提取效果較好，提取率均達(dá)到70%以上；甲酸的提取效果最佳，提取率達(dá)85.6%。結(jié)果表明，在相同的提取劑濃度下，甲酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)SAM 的提取效果明顯高于其他提取劑，選取甲酸為提取劑進(jìn)行條件優(yōu)化研究。

2.2 甲酸濃度和料液比對(duì)SAM回收量的影響

以甲酸為提取劑，分別采用不同濃度（0.4、0.8、1.2、1.6 mol/L）和不同料液比（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7 g/mL），在常溫條件下對(duì)釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)SAM 提取90 min，其回收量結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)料液比為1∶1 g/mL 時(shí)，4 個(gè)濃度梯度的回收量均低于6 mg/g；當(dāng)料液比提高到1∶7 g/mL 時(shí)，回收量均超過(guò)了10 mg/g。表明SAM 的回收量隨料液比的提高而增加。而當(dāng)料液比一定時(shí)，SAM 的回收量則隨著甲酸濃度的提高而增加。其中，料液比為1∶5 與1∶7 g/mL，甲酸濃度為1.2 或1.6 mol/L 時(shí)，SAM 回收量均可達(dá)到11 mg/g 以上，提取效果相當(dāng)，繼續(xù)提高料液比或甲酸濃度不能進(jìn)一步提高SAM 的回收量。因此，綜合考慮甲酸溶液用量及其成本，選擇最適提取劑濃度為1.2 mol/L，料液比為1∶5 g/mL。

圖1 不同提取劑對(duì)SAM 提取率的影響

圖2 甲酸濃度和料液比對(duì)SAM 回收量的影響

圖3 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)SAM 回收量的影響

2.3 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)SAM回收量的影響

以甲酸為提取劑，料液比為1∶5 g/ml、甲酸濃度為1.2 mol/L 時(shí)，在不同提取溫度（15、20、25、30℃）下進(jìn)行不同時(shí)間（1、2、3、4 h）的提取，獲得胞內(nèi)SAM 的回收量如圖3?？梢钥闯觯瑢?duì)釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的處理，均是15℃條件下SAM 回收量高于其他溫度條件，胞內(nèi)SAM 回收量隨提取溫度升高而降低。這是由于SAM 作為一種生物活性分子，在較高溫度下不穩(wěn)定、易降解。當(dāng)提取溫度為15℃、提取時(shí)間為2 h 時(shí)，SAM 回收量達(dá)到最高，為12.68 mg/g；該溫度下，提取時(shí)間延長(zhǎng)至3 h 時(shí)，SAM 回收量下降至12.36 mg/g，4 h 時(shí)為12.18 mg/g。這也與SAM 隨時(shí)間延長(zhǎng)而降解有關(guān)，造成SAM 回收量逐步降低。因此，選取最適提取溫度為15℃、提取時(shí)間為2 h。

2.4 最適甲酸提取條件下SAM提取效果

根據(jù)上述優(yōu)化條件，確定甲酸提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM 的最佳條件為：甲酸濃度1.2 mol/L，料液比1∶5 g/mL，15℃振蕩破碎2 h。此時(shí)，胞內(nèi)SAM 的回收量達(dá)12.68 mg/g。對(duì)胞內(nèi)提取物進(jìn)行UPLC 分析，結(jié)果如圖4?？梢钥闯?，與SAM 標(biāo)準(zhǔn)品相比，釀酒酵母甲酸提取物在SAM 出峰位置有顯著的尖峰，但在SAM 出峰位置之后仍有不顯著的雜峰。這說(shuō)明SAM 為甲酸提取物中的主要成分，但仍有少量雜質(zhì)，需要進(jìn)一步的分離純化以獲得純度更高的SAM 產(chǎn)物。

圖4 釀酒酵母胞內(nèi)SAM 提取物及SAM 標(biāo)準(zhǔn)品UPLC 圖譜

3 討論

近年來(lái)，開(kāi)發(fā)安全、高效、環(huán)保的SAM 提取工藝受到關(guān)注。譚天偉等以硫酸溶液為提取劑，分別在70℃的熱水[14]和4℃的冷水[15]條件下提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM。李繼安等[16]以無(wú)機(jī)強(qiáng)酸水溶液為提取液，同時(shí)輔以?xún)鋈谑侄纹扑榧?xì)胞，提取胞內(nèi)SAM。李勇等[17]采用高壓氮?dú)鈹D壓式細(xì)胞破碎法破碎酵母細(xì)胞，釋放胞內(nèi)SAM。這些工藝均避免了使用危險(xiǎn)性較高的高氯酸溶液，但也都采用了物理方法輔助破碎細(xì)胞，增大了操作復(fù)雜性、增加了能耗。本研究中采用甲酸溶液提取酵母胞內(nèi)SAM，提取率可以達(dá)到95%。有文獻(xiàn)報(bào)道，甲酸對(duì)微藻細(xì)胞有較好的破碎效果[18]。本研究將甲酸用于釀酒酵母細(xì)胞破碎和抽提胞內(nèi)SAM，具有創(chuàng)新性。經(jīng)過(guò)對(duì)提取劑濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等4 個(gè)因素的條件優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，SAM 回收量可達(dá)12.68 mg/g，為SAM 提取工藝的進(jìn)一步規(guī)模放大提供了基礎(chǔ)。

經(jīng)甲酸溶液破碎細(xì)胞和提取后，提取液中主要成分為SAM，但仍然會(huì)有蛋白質(zhì)、多糖、核酸等雜質(zhì)，需要進(jìn)一步分離純化。本課題組已在大孔弱酸樹(shù)脂純化SAM 的工藝方面取得進(jìn)展[19-20]，可作為本研究中甲酸提取工藝的下游工藝，形成SAM 提取、純化的完整工藝流程，為SAM 的高效制備提供理論依據(jù)。