霍雪萍，張琳萍，趙向絨，劉勤社，王海芳

1.陜西省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710068；2.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)，陜西 西安710061；3.陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安712046

WST-1 是一種快速高靈敏度檢測(cè)試劑，廣泛用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖變化檢測(cè)、抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，以及評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用。WST-1檢測(cè)具有線性范圍寬、靈敏度高、溶解性強(qiáng)、操作方便等特點(diǎn)。

已有研究表明，細(xì)胞接種密度不合適可能影響細(xì)胞增殖及毒性研究結(jié)果。管瑩等[1]利用細(xì)胞倍增實(shí)驗(yàn)對(duì)CHO 細(xì)胞不同接種密度下48 h 內(nèi)的細(xì)胞倍增時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，以2×104～6×104/mL 的初始密度接種細(xì)胞，細(xì)胞在連續(xù)48 h 的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)速度較為穩(wěn)定；而以較高密度8×104～10×104/mL 接種細(xì)胞，由于生長(zhǎng)空間有限，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞間的接觸抑制作用導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞停止生長(zhǎng)。孫大勇等[2]證明二氫楊梅素對(duì)A549 細(xì)胞的抗腫瘤作用與給藥時(shí)的細(xì)胞密度有關(guān)，細(xì)胞密度越低，藥物的抗腫瘤作用越強(qiáng)，提示細(xì)胞生存能力與細(xì)胞密度有關(guān)。李光宗等[3]也提出小鼠細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK 細(xì)胞）的初始接種密度為8×106時(shí)有利于細(xì)胞增殖、分化及殺瘤作用的形成，增加細(xì)胞密度到12×106時(shí)，細(xì)胞因過于擁擠導(dǎo)致生長(zhǎng)空間相對(duì)不足而大量死亡。由此可見，合適的細(xì)胞初始接種密度是保證增殖及毒性試驗(yàn)順利完成的基礎(chǔ)，而接種密度的選擇與所用細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募邦A(yù)計(jì)藥物作用都有關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)室在研究藥物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，以及評(píng)價(jià)藥物對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖與毒性試驗(yàn)定量檢測(cè)所得到的結(jié)果常常存在較大差異，有時(shí)甚至出現(xiàn)藥物作用趨勢(shì)的根本不同。鑒于此，我們檢測(cè)了不同細(xì)胞初始接種密度對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，bEND.3）藥物促增殖作用及H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的影響，為建立可靠的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及損傷和藥物作用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)體系探索合適的細(xì)胞密度條件，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

bEND.3 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（上海拜力生物科技有限公司）；RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（Clontech 公司）；WST-1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素和胰蛋白酶（碧云天生物技術(shù)研究所）；活血膠囊（西安大唐制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：B20020336）；30%雙氧水（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Thermo Fisher 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Napco 公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司）；Model 680 型酶標(biāo)儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 活血膠囊（HXJN）水溶液配制

稱取0.9 g 活血膠囊顆粒，研細(xì)，加入6 mL無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，攪拌使之充分溶解，2000 r/min 離心5 min，吸取溶液上層，0.22 μm微孔濾膜過濾分裝，-80℃冰箱保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

bEND.3 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫密閉細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.025%胰蛋白酶消化傳代，每2 d 傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 倒置顯微鏡觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bEND.3 細(xì)胞，胰酶消化，吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以細(xì)胞密度為1500、3000、6000、10 000/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200 μL 完全培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，藥物處理前觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用WST-1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同細(xì)胞接種密度、不同濃度活血膠囊溶液對(duì)bEND.3 細(xì)胞增殖能力的影響。簡(jiǎn)述之，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別以1500、3000、6000/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。次晨按照空白對(duì)照組和藥物組處理，藥物組加入HXJN溶液，使其終濃度分別為300 和750 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL 溶液，分別作用細(xì)胞24、48 和72 h，之后每孔換為事先配好的WST-1 溶液100 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～2 h，充分混勻待檢測(cè)體系，測(cè)定D450nm值。

1.6 氧化應(yīng)激損傷模型

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別以6000 或10 000/孔的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜。次日按空白對(duì)照組與藥物組處理，藥物組加入90 μL H2O2溶液，使終濃度分別為100、200 和300 μmol/L，作用2～2.5 h，之后每孔加入10 μL WST-1 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，充分混勻待檢測(cè)體系，測(cè)定D450nm值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

從Model 680 型酶標(biāo)儀中導(dǎo)出D450nm值，用Ex?cel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，單因素方差分析計(jì)算P值，P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同接種密度對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)（圖1）。接種密度為1500/孔時(shí)，細(xì)胞呈多角形或不規(guī)則形，散在生長(zhǎng)，細(xì)胞間空隙較大，互相之間基本無接觸；接種密度為3000/孔時(shí)，部分細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則呈梭形，細(xì)胞之間開始發(fā)生連接；接種密度為6000 和10 000/孔時(shí)，隨細(xì)胞密度的增高，細(xì)胞形態(tài)更加規(guī)則，大多呈梭形，密集處呈明顯的鋪路石狀生長(zhǎng)，細(xì)胞之間相互連接、密集成片生長(zhǎng)。

2.2 不同接種密度對(duì)細(xì)胞增殖的影響

據(jù)統(tǒng)計(jì)96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約為1×105個(gè)。按照細(xì)胞在接種后24 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期計(jì)算，細(xì)胞的初始接種密度最大為6000/孔，培養(yǎng)72 h 可長(zhǎng)滿。如圖2 所示，細(xì)胞初始接種量為1500/孔時(shí)，與空白組相比，HXJN 組在24 和48 h檢測(cè)D450nm值無升高，且隨藥物濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖有一定的抑制作用；然而在72 h時(shí)檢測(cè)，藥物顯示出一定的促增殖作用。細(xì)胞初始接種量為3000/孔時(shí)，在24 h 檢測(cè)D450nm值升高不明顯，而48 和72 h 時(shí)HXJN 組顯示顯著的促增殖作用，但不同劑量組之間作用無顯著差異。細(xì)胞初始接種量為6000/孔，在24 h 檢測(cè)時(shí)藥物作用不明顯，48、72 h 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物促增殖作用明顯升高，且顯示出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 不同細(xì)胞接種密度對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的影響

如圖3，隨細(xì)胞接種量的不同，H2O2對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的程度存在明顯差異。細(xì)胞初始接種量為6000/孔時(shí)，H2O2濃度為100 μmol/L 可引起顯著的細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率為50%左右；H2O2濃度為200 和300 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞受損嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，幾乎全部呈脫落、漂浮和破碎狀態(tài)。細(xì)胞初始接種量為10 000/孔時(shí)，100 μmol/L H2O2濃度下細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)良好；H2O2濃度為200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，變圓、皺縮、破碎和脫落漂浮現(xiàn)象明顯，細(xì)胞存活率為50%左右；300 μmol/L 時(shí)，培養(yǎng)液中死亡細(xì)胞數(shù)目增多，大多數(shù)細(xì)胞呈脫落、漂浮和破碎狀態(tài)，存活率僅為25%左右。

圖1 不同接種密度下的細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖2 不同初始接種密度對(duì)HXJN促細(xì)胞增殖作用的影響

圖3 不同初始接種密度對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的影響

3 討論

我們用WST-1 試劑檢測(cè)中藥復(fù)方HXJN 對(duì)bEND.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞的72 h 促增殖作用，結(jié)果表明藥物對(duì)bEND.3 細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，而細(xì)胞初始接種密度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。細(xì)胞接種密度為1500/孔時(shí)，藥物的促增殖作用不明顯；接種密度為3000 和6000/孔時(shí)，可見顯著的藥物促增殖作用，并可觀察到劑量-效應(yīng)關(guān)系。適宜的初始接種密度是觀察細(xì)胞增殖作用的先決條件，密度過高或過低均不利于觀察藥物的促增殖作用。

在構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)bEND.3 細(xì)胞氧化損傷模型時(shí)，選定合適的初始接種密度同樣重要。我們的結(jié)果顯示，初始接種量為6000/孔，100 μmol/L H2O2作用2 h，細(xì)胞存活率約為50%；而當(dāng)初始接種量為10 000/孔時(shí)，200 μmol/L H2O2作用下細(xì)胞的存活率約為50%。這提示由于細(xì)胞初始接種密度不同，導(dǎo)致同一濃度H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度顯著不同。因此，在進(jìn)行氧化損傷和藥物篩選、作用機(jī)制研究時(shí)，須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選定合適的細(xì)胞接種密度并在整個(gè)研究過程中保持一致，才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

細(xì)胞接種密度較大時(shí)，細(xì)胞間連接增加，可能通過某種機(jī)制影響細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，影響細(xì)胞的增殖和抗氧化損傷能力。血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接主要有4 種類型，即縫隙連接、緊密連接、黏附連接和黏合體，而黏附連接是主要的連接，緊密連接和縫隙連接穿插于黏附連接之間，但細(xì)胞間小分子通訊的通道主要還是縫隙連接[4]。陳志從等[5]通過細(xì)胞分子水平驗(yàn)證丹參酮ⅡA 參與增強(qiáng)上皮細(xì)胞縫隙連接通訊的功能，有利于提高藥物的增殖能力及抗氧化損傷能力。除此之外，細(xì)胞密度對(duì)于基因轉(zhuǎn)染效率[6]、成骨細(xì)胞分化[7]和細(xì)胞衰老[8]等許多其他類型的實(shí)驗(yàn)研究也有顯著影響，例如應(yīng)激性細(xì)胞衰老必須在非長(zhǎng)滿的狀態(tài)下進(jìn)行研究，否則會(huì)使背景信號(hào)大大增強(qiáng)。因此，細(xì)胞接種密度不僅是實(shí)驗(yàn)研究中一個(gè)值得注意的重要問題，也是細(xì)胞間信號(hào)傳遞研究中一個(gè)令人感興趣的課題。