王海波， 李　璐， 蘇新國， 張昭其， 龐學(xué)群

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642)

香蕉果實(shí)在貯藏溫度低于12 ℃時(shí)即發(fā)生冷害，難以采用較低的溫度來延長貯運(yùn)期[1-2]。熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效的采后處理措施之一[3]，但熱處理誘導(dǎo)的抗冷機(jī)制目前尚不明確。鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)是植物中重要的第二信使，CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)/SR (signal responsive transcription activator)是一類廣泛存在于真核生物中的含有CaM結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子家族。CaM和CAMTA在植物響應(yīng)逆境中起調(diào)節(jié)作用，對香蕉CaM和CAMTA 的深入研究，有助于進(jìn)一步了解香蕉鈣信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，有助于揭示熱處理提高香蕉果實(shí)抗冷性的作用機(jī)理。CaM參與了植物對高溫、低溫脅迫等的響應(yīng)，并且在植物細(xì)胞對脅迫的適應(yīng)過程中起重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。熱、冷、干旱等多種脅迫都能誘導(dǎo)CAMTA基因上調(diào)表達(dá)[6-7]。擬南芥CAMTA3能同CBF2(C-repeat binding transcription factor)啟動(dòng)子區(qū)域CM2序列(CCGCGT)結(jié)合，激活CBF2等基因的表達(dá)，從而提高擬南芥的抗冷性[8]。筆者所在課題組的前期研究結(jié)果表明，采用52 ℃熱水處理香蕉果實(shí)3 min，能有效減輕香蕉果實(shí)的冷害癥狀[9-10]，但有關(guān)CaM和CAMTA在熱水處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用目前還不明確。分析CaM和CAMTA基因在香蕉熱處理和低溫貯藏中的表達(dá)情況，探討這2個(gè)基因在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用，為有效延長香蕉貯運(yùn)期提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料及處理

香蕉品種為巴西(Musaspp. AAAGroupcv.cavendish)，采自廣東省廣州市番禺香蕉園，及時(shí)運(yùn)回廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。挑選七成飽滿、大小均勻、無病蟲害及機(jī)械損傷的單個(gè)香蕉， 先后用0.1%漂白粉和0.05%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑各浸泡5 min，晾干后備用。

熱水及低溫貯藏處理：將香蕉果實(shí)浸入熱水處理機(jī)(體積400 L)中，溫度52 ℃，時(shí)間3 min。熱水處理后將香蕉果實(shí)放入20 ℃恒溫箱中貯藏3 h，然后置于7 ℃下貯藏5 d；對照處理的香蕉在20 ℃恒溫箱中貯藏3 h，然后置于7 ℃下貯藏5 d。每個(gè)處理100個(gè)香蕉，定期取樣備用。取樣時(shí)間點(diǎn)為：20 ℃下0、0.5、1.5、3.0 h；7 ℃下1.0、4.0、8.0、24.0、48.0、120.0 h。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1脯氨酸含量測定參照Demiral等的試驗(yàn)方法[11]，略有改動(dòng)。取香蕉果皮0.5 g，用5 mL 3%磺基水楊酸提取，沸水浴10 min，冷卻。5 000 r/min離心10 min，取上清液待測。測定：取2 mL上清液，加2 mL水、2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮，沸水浴顯色30～60 min，冷卻。加4 mL甲苯萃取，靜置后取甲苯相測定520 nm下的吸光度(以甲苯為空白對照)。根據(jù)下式計(jì)算脯氨酸含量：單位鮮質(zhì)量樣品中脯氨酸含量(μg/g)=2.5C/W，式中：C為樣品脯氨酸濃度，μg/mL；W為樣品質(zhì)量，g；2.5表示溶液體積為 2.5 mL。

1.2.2實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)根據(jù)已經(jīng)克隆得到的MaCaM和MaCAMTA3基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物，驗(yàn)證后備用。引物序列為MaCaM(5′-ACCGAAGCTGAGCTACAG-3′、5′-ATCCTTCATCTTGCGAGC-3′)和MaCAMTA3(5′-GCAA ATGGTCACAAAGGC-3′、5′-GAGAAGCATTCCGAACAG-3′)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 進(jìn)行qRT- PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20.0 μL，即SYBR-Green PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL，稀釋的cDNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。為了確認(rèn)產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性，在溶解曲線中分析產(chǎn)物的Tm(分析溶解溫度為65～95 ℃)。所有qRT-PCR結(jié)果根據(jù)內(nèi)參基因Actin1進(jìn)行Ct值校準(zhǔn)，再利用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，重復(fù)3次。

1.3　數(shù)據(jù)處理

采用Sigmaplot 12.5制作折線圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　熱激處理及熱激后低溫貯藏對脯氨酸含量的影響

前期研究表明，7 ℃(冷害溫度)下，香蕉果實(shí)在處理后 5 d 已經(jīng)出現(xiàn)明顯的冷害癥狀，利用52 ℃熱水處理(HWD) 3 min 能有效提高香蕉果實(shí)在7 ℃低溫貯藏中的抗冷性[9-11]。從圖1可知，對照香蕉果實(shí)的脯氨酸含量在7 ℃下呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。熱激處理后在20 ℃貯藏期間，香蕉果實(shí)的脯氨酸含量小幅度逐漸增加，且脯氨酸含量略高于對照。當(dāng)熱激后的香蕉果實(shí)轉(zhuǎn)入7 ℃下1 h時(shí)，脯氨酸含量迅速增加至20 ℃貯藏時(shí)的3倍左右，之后呈現(xiàn)出下降上升再下降的趨勢，在整個(gè)7 ℃低溫貯藏期間，熱激處理的香蕉果實(shí)其脯氨酸含量一直明顯高于對照。

2.2　熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaCaM表達(dá)的影響

從圖2可知，對照處理的MaCaM基因表達(dá)在7 ℃下1 h迅速升高至最大值，之后又在7 ℃ 4 h迅速下降，后期持續(xù)在同一個(gè)水平，但表達(dá)量仍高于20 ℃下的表達(dá)量。香蕉果實(shí)經(jīng)過HWD處理后，MaCaM基因表達(dá)呈現(xiàn)快速升高的趨勢，在20 ℃下3 h達(dá)到一個(gè)高峰，MaCaM基因表達(dá)量約為對照的2倍。當(dāng)熱激后的香蕉果實(shí)中轉(zhuǎn)入7 ℃低溫貯藏1 h時(shí)，MaCaM基因表達(dá)量迅速下降至0 d的水平，這與對照的表現(xiàn)相反。7 ℃低溫4～8 h時(shí)，MaCaM基因表達(dá)量迅速增強(qiáng)至最高峰，之后逐漸下降。除7 ℃貯藏1、4 h外，熱激處理的MaCaM基因表達(dá)量均高于對照。

2.3　熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaCAMTA3表達(dá)的影響

從圖3可知，對照處理的MaCAMTA3基因在7 ℃貯藏下1～8 h呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，7 ℃貯藏8～24 hMaCAMTA3基因表達(dá)又增強(qiáng)至20 ℃貯藏時(shí)的水平，之后又開始逐漸下降。香蕉經(jīng)HWD處理后3 h，MaCAMTA3基因表達(dá)逐漸升高至最大值，約是對照處理的1.4倍，然而當(dāng)果實(shí)轉(zhuǎn)入7 ℃后1 h，MaCAMTA3基因表達(dá)量出現(xiàn)短暫而迅速的下降，且低于對照。之后其表達(dá)量逐漸上升，在7 ℃ 8～24 h達(dá)到一個(gè)高峰，之后又開始逐漸下降。除7 ℃貯藏1、4 h外，HWD處理的MaCAMTA3基因表達(dá)均高于對照。

3　結(jié)論與討論

脯氨酸含量的積累與果實(shí)抗冷性的提高密切相關(guān)[12]。桃果實(shí)中較高的脯氨酸含量明顯提高了桃果實(shí)的抗冷性，而且用外源5 mmol/L脯氨酸處理桃果實(shí)，能明顯降低桃果實(shí)冷害指數(shù)，緩解其冷害癥狀的發(fā)生[13]。10 mmol/L甜菜堿處理可提高黃瓜果實(shí)中脯氨酸含量，從而減輕黃瓜果實(shí)貯藏期間的冷害[14]。外源NO處理能夠通過促進(jìn)香蕉果實(shí)脯氨酸積累和增強(qiáng)體系的抗氧化性，進(jìn)而減輕香蕉冷害[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，熱激能在處理后3 h內(nèi)輕微增加香蕉果實(shí)脯氨酸的含量，而當(dāng)果實(shí)經(jīng)熱激處理后在7 ℃低溫貯藏時(shí)，其脯氨酸含量一直明顯高于對照處理，說明熱激誘導(dǎo)的脯氨酸大量積累與香蕉果實(shí)的抗冷性密切相關(guān)。

熱激處理能在短時(shí)間內(nèi)迅速激活CaM的表達(dá)。例如，擬南芥幼苗經(jīng)過37 ℃熱激后，其AtCaM3基因表達(dá)水平在 20 min 內(nèi)迅速增加并達(dá)到最大值，在30 min后逐漸下降[16]。37 ℃處理玉米幼苗后，其CaM1-2的表達(dá)在10 min后開始迅速增強(qiáng)[4]，本研究也發(fā)現(xiàn)，香蕉果實(shí)經(jīng)過熱激處理后，MaCaM基因表達(dá)呈現(xiàn)快速升高的趨勢，在處理后3 h達(dá)到一個(gè)高峰。CaM也參與了植物的低溫脅迫反應(yīng)。例如，茶樹在4 ℃低溫脅迫下，CsCaM1與CsCaM2基因的表達(dá)量從3 h開始逐漸上升，于24 h達(dá)到最大值[17]。 4 ℃低溫能誘導(dǎo)小麥幼苗TaCaM5的表達(dá)量在1 h后迅速升高，3 h達(dá)到最高峰，之后又迅速下降至處理前的水平[18]。本研究結(jié)果與之類似，7 ℃ 低溫誘導(dǎo)香蕉果實(shí)的MaCaM基因表達(dá)在1 h迅速升高至最大值，之后又在4 h迅速下降，后期維持在一個(gè)較低的水平。而經(jīng)熱激處理后在7 ℃低溫貯藏的香蕉果實(shí)，MaCaM基因表達(dá)高峰推遲出現(xiàn)在4 h，除低溫貯藏1、4 h外，熱激處理的MaCaM基因表達(dá)均高于對照。以上結(jié)果說明，MaCaM可能參與了熱激處理誘導(dǎo)香蕉果實(shí)抗冷性的過程。

熱處理和低溫都能誘導(dǎo)CAMTA基因的表達(dá)。42 ℃熱處理能誘導(dǎo)擬南芥幼苗的AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這5個(gè)基因在15 min開始上調(diào)表達(dá)，尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA5、AtCAMTA6這3個(gè)基因在熱處理4 h內(nèi)均維持較高的表達(dá)水平。類似地，4℃低溫也能誘導(dǎo)擬南芥幼苗AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這5個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)，尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這4個(gè)基因在低溫處理4 h內(nèi)均保持較高的表達(dá)水平[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)，熱處理能誘導(dǎo)香蕉果實(shí)MaCAMTA3基因表達(dá)在處理后3 h內(nèi)迅速增強(qiáng)，7 ℃ 低溫貯藏下MaCAMTA3基因表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，而經(jīng)過熱激處理后在7 ℃低溫貯藏的香蕉果實(shí)，除低溫貯藏1、4 h外，MaCAMTA3基因表達(dá)均高于對照。說明熱激處理誘導(dǎo)MaCAMTA3基因較高的表達(dá)水平，可能參與了熱激處理誘導(dǎo)香蕉果實(shí)產(chǎn)生的抗冷性。

熱處理能誘導(dǎo)香蕉果實(shí)在低溫貯藏中的脯氨酸含量升高，從而提高果實(shí)抗冷性。MaCaM和MaCAMTA3基因可能參與了熱激處理誘導(dǎo)香蕉果實(shí)產(chǎn)生的抗冷性。

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